论文摘要
目的:从人脂肪组织中克隆SelS基因片段,构建pcDNA3.1-SelS真核表达载体。将pcDNA3.1-SelS瞬时转染至人脐静脉内皮细胞株（ECV304）中,分别从mRNA水平及蛋白水平检测SelS基因在ECV304细胞中的表达。瞬时转染后将ECV304细胞分为未转染组、SelS转染组（SelS高表达组）及空载体转染组,以不同浓度的过氧化氢（H2O2）损伤后,观察各组细胞损伤前后的氧化应激指标及窖蛋白-1（Caveolin-1,Cav-1）表达水平的差异,探讨Caveolin-1是否与SelS抗氧化作用有关,为深入研究SelS内皮保护的作用机制提供新的实验依据。方法:1.采用RT-PCR方法从人脂肪组织中获取SelS基因片段（79645bp）,通过两次亚克隆将目的基因克隆于pcDNA3.1真核表达载体中,获得真核表达载体质粒pcDNA3.1-SelS,并行EcoRI/XhoI酶切鉴定及测序鉴定。2.应用脂质体转染技术分别将pcDNA3.1-SelS及pcDNA3.1瞬时转染至ECV304细胞中,从而将ECV304细胞分为SelS转染组及空载体转染组,同时以未转染组ECV304细胞作为对照。以GAPDH为内参照半定量检测SelS mRNA水平的表达;以β-actin为内参照,Western blot方法检测SelS蛋白水平的表达。3.各组细胞分别经含有终浓度为0、400、600、800、1000μmol/L的H2O2的培养液作用6小时后,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）观察H2O2对细胞增殖能力的影响;取不同浓度各组细胞上清液,硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）的含量,黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（SOD）的活力。4 .根据MTT结果,选取细胞生存率适度减低的含H2O2浓度800μmol/L的培养液作用各组细胞6小时后,提取各组细胞总RNA,采用RT-PCR方法检测各组细胞Caveolin-1的mRNA表达水平。结果:1.从人脂肪组织中提取的总RNA是完整的,SelS基因cDNA测序结果与Genebank中的序列（NM-018445）相一致。经XhoI和EcoRI酶切及测序鉴定证实pcDNA3.1-SelS真核表达载体质粒构建成功。2.RT-PCR、Western blot检测证实SelS在ECV304细胞中有内源性表达,同时半定量分析显示SelS转染组的SelSmRNA及蛋白表达水平均较未转染组及空载体转染组明显升高（P<0.01）,未转染组与空载体转染组表达无差异（P<0.01）。3.细胞生存率（%）:ECV304细胞暴露于含不同浓度的H2O2的培养液中6小时后,细胞生存率明显下降;在H2O2浓度为800、1000μmol/L时,SelS转染组（34±10,27±15）的细胞生存率明显高于未转染组（32±12,24±9）及空载体转染组（31±14,23±10）（P<0.01）,空载体转染组与未转染组相比差异不显著（P>0.05）。4.MDA含量（nmol/mL）:各组细胞上清液中MDA的含量随着H2O2浓度的升高而增加;在H2O2浓度为600、800、1000μmol/L时,SelS转染组的MDA水平（3.50±0.07,6.30±0.07,10.50±0.08）均低于未转染组（6.40±0.03,10.40±0.11,18.00±0.07）及空载体转染组（5.80±0.08,9.00±0.09, 16.40±0.19） , H2O2浓度为1000μmol/L时差异更为显著（P<0.05,P<0.05,P<0.01）,空载体转染组与未转染组相比差异不显著（P>0.05）。5.SOD活力（U/ml）:各组细胞上清液中SOD的活力随着H2O2浓度的升高而减弱;在H2O2浓度为600、800、1000μmol/L时,SelS转染组的SOD活力（8.34±0.16,7.48±0.87,6.60±1.58）明显高于未转染组（ 7.52±0.29, 5.70±0.22, 4.62±2.33）及空载体转染组（ 7.12±1.63,6.10±1.78,5.00±1.27）,在H2O2浓度800、1000μmol/L时升高更为明显（P<0.05,P<0.01,P<0.01）;空载体转染组与未转染组相比无差异（P>0.05）。6.Caveolin-1 mRNA的表达:ECV304细胞暴露于含不同浓度H2O2的培养液中6小时后,与损伤前相比,未转染组（0.74±0.01 vs 0.48±0.01,P<0.01）、SelS转染组（0.67±0.01 vs 0.63±0.01,P<0.05）及空载体转染组（7.12±1.63 vs 0.58±0.01,P<0.01）均明显升高;H2O2损伤后,SelS转染组（0.67±0.01）明显低于未转染组（0.74±0.01）（P<0.01）及空载体转染组（7.12±1.63）（P<0.01）,而未转染组与空载体转染组比较无差异（P>0.05）。结论:1.成功构建pcDNA3.1-SelS真核表达载体,将pcDNA3.1-SelS瞬时转染至ECV304细胞中,并证实ECV304细胞中有SelS的内源性表达。2.高表达SelS可明显减弱H2O2对内皮细胞生长的抑制作用,减少氧化应激时MDA的生成,增强SOD的活力,对内皮细胞具有保护作用。3. H2O2可以上调ECV304细胞Caveolin-1的表达,SelS高表达则可以抑制Caveolin-1的上调,说明SelS保护ECV304细胞免于H2O2损伤作用与Caveolin-1有关。
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