牛卵巢保存方法对卵母细胞体外成熟和体外发育的影响

论文摘要

随着牛体外受精技术和胚胎移植技术在生产应用中的快速发展,以及牛体细胞核移植和转基因等胚胎工程技术的深入开展,如何稳定获得高质量的成熟卵母细胞已经成为该领域中的一个极其重要的问题。卵母细胞虽然可以通过超数排卵、活体采卵等方式获得,但其成本高昂,无法广泛开展。因此目前广泛被采用的方法主要是通过收集屠宰场废弃的卵巢来获得体外成熟卵母细胞。在某些特定的条件下,卵巢的收集和运输往往需要较长的时间,同时屠宰时间大多数都在夜间进行,给后续的工作带来许多不便。如果能够建立良好的卵巢保存体系,使其在一定时间内的储存不对卵母细胞的体外成熟和成熟后的发育能力造成不利影响,那么就会为相应的研究工作和生产应用带来极大的便利。本实验针对该问题,以卵母细胞体外成熟效果和成熟卵母细胞的后续发育能力为主要衡量指标,研究了“生物保鲜剂”、温度和储存时间等因素对牛卵巢保存效果的影响,同时以体外成熟的卵母细胞为核受体开展了初步的牛体细胞核移植研究。实验结果如下:1.低温4℃保存牛卵巢0h、3h、6h和8h,卵母细胞的成熟率分别为69.27%、67.95% 67.25%和47.98%,孤雌激活后卵裂率分别为36.99%、31.76%、36.77%和16.61%,囊胚率分别为14.16%、15.56%、14.43 %和0%,低温4℃保存0h、3h和6h三组卵母细胞的成熟率、孤雌激活后的卵裂率和囊胚率差异不显著（P>0.05）,而低温4℃保存8h组卵母细胞的成熟率、卵裂率和囊胚率显著低于其它三组（P<0.01）;2.低温4℃添加生物保鲜剂保存牛卵巢0h、3h、6h和8h,卵母细胞的成熟率分别为71.67%、69.57%、68.22%和67.14%,孤雌激活后卵裂率分别为36.99%、33.47%、32.29%和31.10%,囊胚率分别为14.63%、16.43%、13.89%和13.53%,四组之间各项指标差异不显著（P>0.05）;低温4℃添加生物保鲜剂保存牛卵巢8h组与低温4℃保存牛卵巢8h组之间各项指标差异极显著（P<0.01）;3.室温（15--20℃）添加生物保鲜剂保存牛卵巢0h、3h、6h、8h ,卵母细胞的成熟率分别为78.53%、71.32%,75.16%和77.98%,孤雌激活后胚胎卵裂率分别为38.63%、36.19%,33.87%和33.17%,囊胚率分别为18.28%、17.56%,16.85%和17.43%,四组之间各项指标差异不显著（P>0.05）;室温（15--20℃）添加生物保鲜剂保存牛卵巢8h组与低温4℃添加生物保鲜剂保存牛卵8h组之间卵母细胞的成熟率差异显著（0.05<P<0.01）,孤雌激活后卵裂率和囊胚率差异不显著（P>0.05）;4.成熟培养液液中添加EGF 0ng/ml、10ng/ml、30ng/ml,卵母细胞的成熟率分别为64.86%、70.61%、72.27%,核移植胚胎激活后卵裂率分别为60.71%、80.61%、82.61%,囊胚率分别为11.88%、23.81%、25.00%.成熟培养液液中添加EGF 10ng/ml组与30ng/ml组之间各项指标无明显差异（P>0.05）;与添加EGF 0ng/ml组之间各项指标差异极显著（P<0.01）;结果表明添加生物保鲜剂可以延长牛卵巢的保存时间;室温（15--20℃）添加生物保鲜剂的保存效果优于低温4℃添加生物保鲜剂:成熟培养液中添加EGF10ng/ml可以有效地提高卵母细胞的体外成熟及核移植胚胎的发育。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 卵巢保存的研究概况
• 1.1.1 卵巢保存的研究现状
• 1.1.2 卵巢保存技术的发展历史
• 1.1.3 卵巢保存在动物研究中的应用
• 1.2 卵母细胞体外成熟
• 1.2.1 卵母细胞生长发育机理
• 1.2.2 卵母细胞体外成熟的研究进展
• 1.2.3 卵母细胞体外成熟的判定
• 1.2.4 卵母细胞体外成熟存在的问题及发展前景
• 1.3 体外成熟卵母细胞衍生的胚胎发育
• 1.3.1 卵母细胞的激活原理
• 1.3.2 孤雌胚胎
• 1.3.3 体外受精（IVF）胚胎
• 1.3.4 体细胞核移植（SCNT）胚胎
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 牛卵巢
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 牛卵巢的保存
• 2.2.2 牛卵母细胞的培养
• 2.2.3 牛体细胞核移植
• 2.2.4 牛胚胎的激活与培养
• 2.2.5 胚胎移植
• 3 结果
• 3.1 低温4℃保存牛卵巢对胚胎体外发育的影响
• 3.2 添加生物保鲜剂室温（15-20℃）保存牛卵巢对胚胎体外发育的影响
• 3.3 添加生物保鲜剂4℃保存牛卵巢对胚胎体外发育的影响
• 3.4 EGF 对牛卵母细胞成熟及核移植胚发育的影响
• 4 讨论
• 4.1 低温4℃保存牛卵巢对卵母细胞体外成熟及发育的影响
• 4.2 添加生物保鲜剂对卵母细胞体外成熟及发育的影响
• 4.3 添加EGF 对卵母细胞体外成熟及发育的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文