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米曲霉碱性蛋白酶的异源表达和定向进化以及遗传改造

2020-11-28阅读(674)

米曲霉碱性蛋白酶的异源表达和定向进化以及遗传改造

论文摘要

米曲霉（Aspergillus oryzae）在食品工业中应用极为广泛,在豆酱酿造业中的地位尤为重要。为了保证质量和提高生产效率,豆酱的工厂化生产已采用纯菌种发酵,目前广泛使用的菌种是米曲霉（A. oryzae）3.042。为了不断发掘米曲霉新菌种并通过基因工程加以改良以满足豆酱工业化生产的要求,本研究以分离自东北地区的野生米曲霉为研究对象,对其进行紫外诱变,最终筛选出蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株米曲霉（A. oryzae）Y29,其中性蛋白酶活力是米曲霉（A. oryzae）3.042的1.2倍。与米曲霉（A. oryzae）3.042相比,米曲霉（A. oryzae）Y29菌株发酵豆酱的氨态氮含量达到0.74g/100mL,发酵周期提前2d结束,其它指标无显著差异。豆酱的发酵过程主要是蛋白酶的作用,通过添加蛋白酶抑制剂的方法对发酵过程中的蛋白酶活力进行了测定,结果证明米曲霉碱性蛋白酶在发酵中起关键作用。偏酸性的发酵环境不利于米曲霉碱性蛋白酶更大限度的发挥作用,有必要对其定向进化使其最适pH值下降,这需要高效异源表达系统的支持。本试验采用RT-PCR的方法获得了米曲霉（A. oryzae）Y29的碱性蛋白酶基因（alp）,分别采用天然信号肽和α-信号肽将该基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中进行异源表达,表达量分别为513mg/L和336mg/L。这两种信号肽均能被毕赤酵母识别、加工,并发现前导区对米曲霉alp基因在毕赤酵母中表达是必须的。为了研究表达后的重组米曲霉碱性蛋白酶的性质,采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析对该酶进行了纯化,其纯度已达到电泳纯。重组和天然米曲霉碱性蛋白酶均未被糖基化,最适温度和最适pH也均为40℃和9.0,两者具有相似的pH稳定性和对金属离子及蛋白酶抑制剂的敏感性,但重组酶的热稳定性稍低一些。对含天然信号肽的重组米曲霉碱性蛋白酶的诱导条件进行优化,当诱导温度为28.13℃、诱导pH为6.56、甲醇添加量为1.23%时,其表达量可达648mg/L。以毕赤酵母表达系统和纯化条件为基础,采用重叠PCR法对米曲霉碱性蛋白酶进行了定向进化。首先利用SWISS-MODEL分子模建服务系统同源模建了米曲霉碱性蛋白酶三维结构。再通过同源蛋白序列比对和三维结构结果,找出在活性中心附近且非常保守的氨基酸G78、A230和G236作为待突变位点。以重组米曲霉碱性蛋白酶野生型为对照,通过重叠PCR法进行定点突变并将米曲霉碱性蛋白酶突变酶基因在毕赤酵母中表达,表达产物经纯化后对其酶学性质进行比较,发现突变酶G78R（将78位氨基酸G突变为R）和A230E的最适pH值没有改变,突变酶G78D和G236D的最适pH值均下降了0.5个单位。突变酶G78D在pH值为5.58.5时的碱性蛋白酶的活力均高于野生型（平均高12%左右）;在40℃、pH值9.0时,该突变酶的Km为野生型的115.27%,Vmax和Kcat分别是野生酶的85.89%和82.01%;但热稳定性与野生型差异不显著。而突变酶G236D的比酶活只有野生型的60%左右,所以只有突变酶G78D符合本试验的要求。为了将改造后的米曲霉碱性蛋白酶突变型G78D基因再回到米曲霉中发挥作用,首先构建了含米曲霉alp基因的同源臂和潮霉素B抗性（hygr）基因的置换型打靶载体pHC2,将其线性化后转化米曲霉（A. oryzae）Y29,得到了alp基因敲除的菌株米曲霉（A. oryzae）Y30。又构建了含米曲霉碱性蛋白酶突变型G78D基因的打靶载体pHC3,通过PEG介导转化米曲霉（A. oryzae）Y30,最终得到了米曲霉（A. oryzae）Y31工程菌株。与改造前相比,米曲霉（A. oryzae）Y31菌株的酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力都相应增加了11.23%和13.36%。以米曲霉（A. oryzae）Y29和3.042为对照,用米曲霉（A. oryzae）Y31发酵豆酱,其氨态氮的含量达0.80g/100mL（Y29和3.042菌株分别为0.74g/100mL和0.70g/100mL）,发酵周期为35d（Y29和3.042菌株分别为38d和40d）,酱色稍深,鲜味更浓,其它指标无明显差异但均符合豆酱国家专业标准（SB/T 10309-1999）。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  • 1.1 课题背景与目的意义
  • 1.2 米曲霉的生物学特性及其在食品工业中的应用
  • 1.2.1 米曲霉的生物学特性
  • 1.2.2 米曲霉在食品工业中的应用
  • 1.2.3 国内外豆酱的工业生产方法及采用的菌种
  • 1.3 碱性蛋白酶的性质、应用及基因工程改性
  • 1.3.1 碱性蛋白酶的性质及应用
  • 1.3.2 碱性蛋白酶基因工程改性研究进展
  • 1.4 毕赤酵母表达系统研究进展
  • 1.4.1 毕赤酵母表达系统的特点
  • 1.4.2 影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素
  • 1.5 蛋白质三级结构预测及定向进化方法
  • 1.5.1 蛋白质三级结构预测
  • 1.5.2 蛋白质的定向进化方法
  • 1.6 基因打靶技术的研究进展
  • 1.6.1 基因打靶技术概述
  • 1.6.2 基因打靶技术的应用
  • 1.7 课题的主要研究内容
  • 第2章 实验材料与方法
  • 2.1 实验材料
  • 2.1.1 菌株和质粒
  • 2.1.2 培养基
  • 2.1.3 酶和试剂
  • 2.1.4 实验主要仪器
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 米曲霉菌种选育及发酵性能分析
  • 2.2.2 米曲霉碱性蛋白酶基因（alp）的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达
  • 2.2.3 重组碱性蛋白酶的纯化、酶学性质研究及其诱导条件的优化
  • 2.2.4 米曲霉碱性蛋白酶分子定向进化
  • 2.2.5 米曲霉碱性蛋白酶基因的遗传改造
  • 第3章 米曲霉菌种选育及发酵性能分析
  • 3.1 紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株
  • 3.1.1 米曲霉产酶曲线的测定
  • 3.1.2 诱变出发菌株的选择
  • 3.1.3 诱变条件的选择
  • 3.1.4 紫外诱变初筛及复筛
  • 3.1.5 遗传稳定性测定
  • 3.2 米曲霉（A. oryzae）Y29 和3.042 的生物学特性及发酵性能分析
  • 3.2.1 生物学特性
  • 3.2.2 发酵性能分析
  • 3.3 本章小结
  • 第4 章米曲霉碱性蛋白酶基因（alp）的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达
  • 4.1 米曲霉alp 基因的克隆与序列分析
  • 4.1.1 米曲霉总RNA 的提取
  • 4.1.2 RT-PCR 扩增米曲霉alp 基因
  • 4.1.3 米曲霉alp 基因的克隆和序列分析
  • 4.2 米曲霉alp 基因在毕赤酵母中的高效表达
  • 4.2.1 重组酵母表达载体的构建
  • 4.2.2 重组酵母表达载体的鉴定
  • 4.2.3 酵母转化子的获得
  • 4.2.4 酵母转化子的甲醇利用表型筛选
  • 4.2.5 多拷贝整合的酵母转化子筛选
  • 4.2.6 酵母转化子的PCR 鉴定
  • 4.2.7 重组毕赤酵母菌株的筛选
  • 4.2.8 米曲霉alp 基因在毕赤酵母中的高效表达和时间曲线研究
  • 4.2.9 重组米曲霉碱性蛋白酶的N 端氨基酸序列分析
  • 4.2.10 重组米曲霉碱性蛋白酶酵母工程菌的遗传稳定性分析
  • 4.3 米曲霉alp 基因的前导区对其在毕赤酵母表达中的必要性
  • 4.3.1 米曲霉碱性蛋白酶成熟肽编码基因（alp-m）的PCR 扩增
  • 4.3.2 重组表达质粒的构建和鉴定
  • 4.3.3 转化及高拷贝转化子的筛选
  • 4.3.4 表达产物的碱性蛋白酶活力测定和SDS-PAGE 分析
  • 4.3.5 转化子的Northern-blot 检测
  • 4.4 本章小结
  • 第5章 重组碱性蛋白酶的纯化和酶学性质研究及其诱导条件的优化
  • 5.1 重组和天然米曲霉碱性蛋白酶的纯化及糖基化分析
  • 5.1.1 重组米曲霉碱性蛋白酶的纯化
  • 5.1.2 天然米曲霉碱性蛋白酶的纯化
  • 5.1.3 重组和天然米曲霉碱性蛋白酶的糖基化分析
  • 5.2 重组和天然米曲霉碱性蛋白酶的酶学性质研究
  • 5.2.1 最适反应温度
  • 5.2.2 最适反应pH
  • 5.2.3 热稳定性
  • 5.2.4 pH 稳定性
  • 5.2.5 金属离子和蛋白酶抑制剂对酶活性的影响
  • 5.3 响应面法优化重组毕赤酵母表达米曲霉碱性蛋白酶诱导条件
  • 5.3.1 单因素实验结果
  • 5.3.2 Plackett-Burman 设计筛选影响重组米曲霉碱性蛋白酶表达的显著因素
  • 5.3.3 响应面法优化重组米曲霉碱性蛋白酶表达的诱导条件
  • 5.4 本章小结
  • 第6章 米曲霉碱性蛋白酶分子定向进化
  • 6.1 米曲霉碱性蛋白酶三维结构的同源模建
  • 6.1.1 序列相似性搜索
  • 6.1.2 模体搜索
  • 6.1.3 结构域分析
  • 6.1.4 三维结构模建
  • 6.2 米曲霉碱性蛋白酶的定向进化
  • 6.2.1 突变位点的选择
  • 6.2.2 定点突变和表达载体的构建及序列测定
  • 6.2.3 突变的米曲霉碱性蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达及纯化
  • 6.2.4 突变酶的酶学性质比较
  • 6.3 本章小结
  • 第7章 米曲霉碱性蛋白酶基因的遗传改造
  • 7.1 米曲霉alp 基因的敲除
  • 7.1.1 靶基因（米曲霉alp 基因）同源臂（A，B）序列的克隆
  • r）基因的打靶载体pHC2 的构建'>7.1.2 含潮霉素B 抗性（hygr）基因的打靶载体pHC2 的构建
  • 7.1.3 利用打靶载体pHC2 敲除米曲霉alp 基因
  • 7.2 米曲霉（A. oryzae）Y31 工程菌株的获得
  • 7.2.1 构建含米曲霉碱性蛋白酶突变型G78D 基因的打靶载体pHC3.
  • r 基因'>7.2.2 利用pHC3 敲除米曲霉（A. oryzae）Y30 中hygr基因
  • 7.2.3 米曲霉（A. oryzae）Y31 的蛋白酶活性和发酵性能分析
  • 7.3 本章小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 致谢
  • 个人简历

    • 相关论文文献

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