论文摘要
糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）全身微血管病变的肾脏表现，为DM常见的慢性并发症之一。目前，DM已成为继肿瘤、心脑血管病之后第3位严重危害人类健康的慢性疾病，全球约有1.35亿名DM患者，我国估算为3000～4000万人，且发病率有不断增高的趋势。DN一旦出现大量蛋白尿，提示预后不良，常进展至终末期肾衰，给个人和社会造成巨大负担，因此对出现微量白蛋白尿（MAU）的早期DN进行积极治疗显得尤为重要，可以明显减少临床期DN的发病率或者延缓临床期DN的发生。本实验分两部分研究了治疗DN的经验方剂肾康丸，第一部应用肾康丸对DN大鼠模型进行干预，观察大鼠体重、肾重、相对肾重、尿微量白蛋白、24小时尿蛋白定量、血糖、血肌酐、血尿素氮、血总胆固醇、血甘油三酯、肾脏病理变化及利用免疫组化技术观察肾小球足细胞desmin表达改变的情况，探讨肾康丸对DN大鼠肾保护作用的可能机制；第二部分应用免疫组化及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测肾康丸治疗后DN大鼠肾小球足细胞nephrin抗原及其mRNA表达的情况，观察肾康丸对DN大鼠肾小球足细胞nephrin表达的影响。第一章肾康丸对DN大鼠足细胞desmin表达的影响目的：观察desmin在DN大鼠模型肾小球足细胞表达的变化，探讨肾康丸对DN大鼠肾保护作用的可能机制。方法：1、动物模型及分组：所有动物适应性喂养1周后，禁食12小时，随机选取雄性SD大鼠34只，按空腹状态下、一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）55mg／kg，72小时后监测血糖，以连续三次空腹血糖＞16.6mmol／L、尿糖强阳性、尿量＞原尿量150％、尿微量白蛋白定性测量阳性者为成模标准。4周后将模型大鼠随机分为4组（n=7）：肾康丸组、厄贝沙坦组（安博维）、肾康丸和厄贝沙坦合用组、模型组，另外6只SD大鼠设为正常对照组。2、药物剂量设定与给药：按大鼠（200 g）与成人（70 kg）的体表面积比1／56，可算出大鼠的等效剂量。肾康丸组大鼠等效量：350mg／日，肾康丸成药经研磨后用蒸馏水配成350mg／ml溶液，每日灌液量1ml，8周。厄贝沙坦组大鼠等效量：3mg／日，安博维片经研磨后用蒸馏水配成3mg／ml溶液，每日灌液量1ml，8周。肾康丸和厄贝沙坦合用组大鼠等效量：肾康丸成药350mg、安博维片3mg经研磨后用蒸馏水配成353mg／ml溶液，每日灌液量1ml，8周。模型组、正常对照组大鼠均以每日1ml生理盐水灌服、持续8周。3、大鼠一般情况及体重、肾重、相对肾重、尿蛋白、血生化的观察：对大鼠毛色、精神状态、饮食量、活动等一般情况进行观察及采用酶联免疫吸附法（ELASA）定性测量尿微量白蛋白，采用Bradford法定量测定24小时尿蛋白，采用OlimpasAU600自动生化分析仪检测血糖、血尿素氮、血肌酐、血总胆固醇、血甘油三酯。4、大鼠肾组织病理标本采集：实验末每组剩6只大鼠，解剖大鼠后，摘除肾脏，去包膜，称重，剪取部分肾组织，厚约4mm，于10％中性甲醛固定液中固定24小时，行HE染色及免疫组化，再取1mm3左右大小的肾组织4～5块，置于2.5％戊二醛中，4℃保存，用作电镜检查，分别观察各组肾小球足细胞、足突的形态结构。5、Desmin免疫组织化学染色：组织切片脱蜡至水后，经PBS冲洗，滴加3％H2O2孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，切片置摇床上以PBS浸洗5分钟，反复3次，取一抗工作液（兔抗desmin抗体（1：100））50μl覆盖组织片，置洁净塑料盒盖上盖防蒸发，室温孵育60分钟。切片再置摇床上以PBS浸洗5分钟，反复3次，滴加EnVision标记二抗，室温孵育30分钟；再在摇床上以PBS浸洗5分钟，反复3次，拭去组织片周围多余液体，加100μl预配制的DBA显色液盖满组织片，孵育5分钟左右，显微镜下控制染色，PBS冲洗后，置摇床上PBS浸洗3分钟，反复3次；再滴加苏木素液2滴至组织片上，5分钟后自来水冲洗干净，滴加0.5％盐酸乙醇1滴，10秒后流水冲洗，脱水、透明、中性树胶封片。6、Desmin抗原表达计分：每组取6张切片标本，在高倍镜下随机选择30个肾小球，根据着色面积和强度按法进行半定量评分，desmin阳性表达均定位于肾小球足细胞内，以出现清晰的浅黄色—棕褐色颗粒判定为阳性。反应结果根据胞质、胞膜、细胞核的着色程度计分：胞质、胞膜、细胞核无着色，计0分；淡黄色为或染色面积＜25％，计1分；棕黄色或染色面积在25％～50％之间，计2分；棕褐色或染色面积＞50％，计3分。7、统计方法：应用SPSS13.0统计软件，治疗前后两组间比较采用配对t检验、多组间比较采用重复测量方差分析，治疗后计量资料多组间比较采用One Way ANOVE、SNK检验；方差不齐者首先进行数据变换，若数据变换后仍不齐者采用多个独立样本非参数分析Kruskal-Wallis H检验；多组等级资料非参数分析采用Mann-Whitney U检验。结果：1、STZ注射后4周，采用酶联免疫吸附法测试大鼠尿微量白蛋白，造模大鼠尿微量白蛋白均为阳性。2、各组给药前后24小时尿蛋白定量变化：治疗前后不同组之间有显著差异（F=386.524，P＜0.001）；在治疗前和治疗后均如此，F值分别为81.048和206.922。治疗前模型组、肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组四组间比较无显著差异（P＞0.05），但均较正常对照组显著升高（P＜0.001），治疗后肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组与模型组比较均有显著下降（P＜0.001），但均较正常对照组高（P＜0.001）；肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组三组间比较，前两者无显著差异（P=0.767），但肾康丸组与肾康丸和厄贝沙坦合用组有显著差异（P=0.015）。给药前后比较，模型组24小时尿蛋白定量值显著升高（t=-12.557，P＜0.001），肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组均显著下降（t值分别为：-11.684、-10.494、-4.864，P＜0.001），肾康丸和厄贝沙坦合用组效果最好。治疗前后与五组之间存在交互效应（F=43.760，P＜0.001）。3、各组大鼠体重、肾重、相对肾重、血生化情况：治疗后五组间体重（Bwt）、尿素氮（UN）、肌酐（Cr）、总胆固醇（TC）及甘油三酯（TG）存在显著差异（F分别为331.902、14.199、23.965、96.425、144.617，P＜0.001），肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组均较模型组有显著改善（P＜0.05），但仍较正常对照组差（P＜0.05）。五组间肾重（kwt）、肾重／体重（k／Bwt）、血糖（Glu）秩次比较，也存在显著差异（X2分别为17.458、20.825、34.448，P＜0.001），模型组秩次最高。肾康丸组、肾康丸和厄贝沙坦合用组与厄贝沙坦组比较，前两者TC、TG显著低于厄贝沙坦组（P＜0.01）。4、大鼠肾组织病理结果比较：模型组大鼠处死前可见大量腹水，肾脏外观苍白、肿胀、质地变硬。经HE染色后，模型组镜下可见肾小管大量蛋白管型，肾小管细胞脱落、空泡变性，肾间质炎性细胞浸润，肾小球轻度系膜增生、基底膜未见明显异常；透射电镜（TEM）显示：足突部分融合，足细胞肿胀、破裂、溶解。经药物治疗后各组病理变化均有不同程度的减轻，其中肾康丸和厄贝沙坦合用组效果更为显著。5、各组大鼠肾组织免疫组化desmin抗原的表达：通过光镜放大观察，在模型组、肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组肾小球足细胞均有不同程度表达，在正常对照组切片上无或弱表达，五组间比较差异显著（X2=34.448，P＜0.001），其中肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组着色计分秩次明显低于模型组，但仍高于正常对照组。肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组三组着色计分秩次比较，肾康丸和厄贝沙坦合用组秩次最低。结论：1、中药肾康丸与西药安博维比较，除有相似的肾保护作用外，更能发挥多靶点的肾保护作用，显示出中药在DN的肾保护作用方面有一定的优势。2、肾康丸可降低DN大鼠肾小球足细胞desmin的表达，从而延缓或减轻肾小球足细胞的损伤而发挥肾保护作用。第二章肾康丸对DN大鼠足细胞nephrin表达的影响目的：观察DN大鼠足细胞nephrin抗原及其基因表达的变化，探讨肾康丸治疗DN大鼠的可能机制。方法：1、动物标本采集：实验末每组剩6只大鼠，解剖大鼠，摘取肾脏，称重，去除包膜，经4℃预冷DEPC水反复冲洗肾脏，修剪肾皮质，取约0.1g于EP管，立即保存于-80℃冰箱中待测。2、Nephrin免疫组化及抗原表达计分：Nephrin免疫组化基本步骤同desmin，但需行抗原修复与正常山羊血清封闭。Nephrin免疫组化结果在油镜下进行观察，每组随机选取30个肾小球，根据着色面积和强度按法进行半定量评分。Nephrin阳性表达特定位于肾小球足细胞内，反应结果根据胞质、胞膜、细胞核的着色程度计分：胞质、胞膜、细胞核无着色，计0分；淡黄色为或染色面积＜25％，计1分；棕黄色或染色面积在25％～50％之间，计2分；棕褐色或染色面积＞50％，计3分。3、RT-PCR检测nephrin基因的表达：实验采用RT-PCR法，检测肾康丸对nephrin mRNA表达水平的影响。Trizol法提取和纯化肾组织总RNA，以0.1％DEPC处理水50μl溶解后分装，加RNAin保存于-80℃冰箱。设计Nephrin、GAPDH引物序列，Nephrin：引物1序列为：5′CTGACTGCGGTGGAAGGGAC3′；引物2序列为：5′GCCGACTTGGCATTCATACTCT 3′；GAPDH：引物1序列为：5′AGATCCACAACGGATACATT 3′；引物2序列为：5′TCCCTCAAGATTGTCAGCAA 3′。取总RNA5μl加至一步法RT—PCR试剂盒20μl反应体系，再加0.3μl下游引物，70℃5分钟后置冰上加上游引物0.3μl，补加DEPC处理水至20μl，42℃，60分钟形成cDNA，94℃，5分钟，灭活逆转录酶，然后进行PCR扩增。PCR扩增条件：94℃1分钟，55℃1分30秒，72℃2分钟，72℃延伸7分钟，30个循环，Nephrin扩增产物长度为332bp，GAPDH扩增产物长度为309bp。取扩增产物5μl，加上样缓冲液1μl，在2.0％琼脂糖凝胶中电泳，缓冲液为0.5×TBE电泳缓冲液，恒定电压90v，80分钟。于紫外灯下拍照，将胶片上反应带在Gel Doc1000凝胶成像分析系统中扫描、分析电泳带的灰度，目的基因mRNA表达量=每例标本目的基因凝胶图像平均灰度值／同一标本GAPDH凝胶图像平均灰度值。4、统计学分析：全部数据应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料多组间比较采用One-Way-ANOVE、SNK检验；多组等级资料非参数分析采用Mann-Whitney U检验。结果：1、各组大鼠肾组织免疫组化nephrin抗原的表达：Nephrin阳性表达位于肾小球足细胞内，通过油镜放大观察，在模型组、肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组肾小球足细胞均有不同程度表达，在正常对照组切片上无或弱表达，五组间比较差异显著（X2=14.463，P=0.006），肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组着色计分秩次显著低于模型组，但仍高于正常对照组。肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组三组着色计分秩次比较，肾康丸和厄贝沙坦合用组秩次最低。2、各组大鼠肾组织nephrin mRNA的表达：各组大鼠RT-PCR扩增产物经琼脂糖电泳，Marker标记片断为332 bp和309 bp，符合目的基因长度。各组间相对量比较具有显著性差异（F=62.348，P＜0.001）。Nephrin mRNA表达肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组均较模型组有显著下降（P＜0.001），但仍显著高于正常对照组（P＜0.05）。肾康丸组、厄贝沙坦组、肾康丸和厄贝沙坦合用组三组间比较，厄贝沙坦组与肾康丸组nephrin mRNA表达量无显著差异（P=3.77），但肾康丸和厄贝沙坦合用组与肾康丸组、厄贝沙坦组均存在显著差异（P＜0.05）。结论：1、肾康丸对DN大鼠的肾保护作用可能与调节DN状态下足细胞nephrin表达量有关，通过延缓或抑制nephrin蛋白的损伤，从而维护足细胞结构和功能的完整而发挥减少尿蛋白、延缓DN进展的作用。2、肾康丸与厄贝沙坦合用可能会更为有效地下调DN早期足细胞nephrin的表达，从而发挥更为广泛的肾保护作用。