环孢素固体分散体胶囊的研制及载体促吸收机理的研究

论文摘要

环孢素（cyclosporine A，CyA）是由11个亲脂性氨基酸组成的中性环状多肽，20世纪80年代以来被广泛地应用于临床器官移植，用以提高移植后的存活率，已经成为当前最主要的免疫抑制剂之一。CyA因在水中几乎不溶并受到肠道及肝脏中的代谢酶细胞色素P4503A4（CYP3A4）的代谢和肠道外向转运载体蛋白P-糖蛋白（P-gp）的外排作用，而使口服生物利用度较低（20％-50％）。本文研制CyA固体分散体，并探讨载体对CYP3A活性和P-gp外排作用，以期通过提高CyA溶解度和溶出速度、载体对CYP3A活性和P-gp外排作用的抑制来提高该药物的口服生物利用度。首先，以泊洛沙姆407（F127）、泊洛沙姆188（F68）、硬脂酸聚烃氧（40）酯（PS）及PVPK-29／32为载体，以溶剂法及溶剂—熔融法制备了CyA固体分散体。红外光谱的结果显示，药物与载体间无明显的相互作用；差示扫描量热分析（DSC）、热台显微镜（HSM）、X-射线衍射（PXRD）等结果显示所制备的固体分散体中药物均以无定型或分子状态存在，而在物理混合物中则以结晶形式存在。以F127、F68及PS为载体制备的固体分散体在0.1％十二烷基硫酸钠（SLS）中60min的累积溶出百分率超过90％，而以PVP为载体制备的固体分散体在0.1％SLS中60min的累积溶出百分率则低于70％。以水为溶出介质时，PS／CyA固体分散体随着PS／CyA比例的增大，60min药物累积溶出百分率加大，当PS／CyA比例超过7∶1时，药物溶出速度不随PS增加而加快，在此比例以上的固体分散体的累积溶出百分率均超过90％；而以F68、F127为载体制备的固体分散体在水中的溶出呈现倒钟状，表明这两种载体对药物的增溶作用有限，难以维持药物溶出时的漏槽状态。溶剂-熔融法制备固体分散体过程中的乙醇用量、搅拌速度、水浴温度、粉体粒度在实验范围内均不影响药物的溶出度。最终确定制备条件为：4ml／g的乙醇用量、800rpm的搅拌速度、65℃制备温度及80目粉体。加入2％的微粉硅胶可显著提高粉体的流动性。灌装胶囊后，影响因素实验的结果表明光、高湿及高溫均可使CyA固体分散体胶囊的有关物质含量增加，其中高温还会降低本品的溶出度，高湿（25℃、RH92.5％）条件下易吸潮变质，说明本品对高温和高湿更加敏感，因此产品应密闭防潮包装，并在贮存时避免高温。加速实验及长期试验结果表明，CyA胶囊经双层铝塑复合膜包装后，在40℃／75％RH条件下放置一个月，溶出度即显著下降，PXRD结果显示药物重新析出结晶。在30℃／60％RH放置六个月及在25℃／60％RH贮存十八个月基本稳定。大鼠分别以1mg／100g的剂量灌胃给予CyA固体分散体与Neoral?后，两者的血药浓度—时间曲线相似，CyA固体分散体和Neoral?的各动力学参数如下：Cmax分别为2348.65±495.96和2557.38±555.09ng／mL；Tmax分别为2.00±0.67和1.71±0.67h、AUC0-60分别为40283.99±5203.16和41021.10±6239.87ng／mLh；MRT0-60分别为17.96±1.88和17.97±1.29h。CyA固体分散体的AUC为Neoral?的98.20％，表明CyA制成固体分散体后，大鼠口服后可有效地促进药物在胃肠道的吸收，达到与自微乳化制剂相似的吸收效果。健康志愿者单次口服CyA固体分散体胶囊与参比制剂自微乳化软胶囊后，CyA固体分散体和Neoral?的各动力学参数如下：Cmax分别为1500.3±348.8和1742.9±361.3ng／mL；Tmax分别为2.63±0.55和1.39±0.49h；AUC0.24分别为7993.0±2535.1和8295.6±2295.6ng／mLh；AUC0-∞分别为8851.7±2815.0和9258.0±2523.7ng／mLh；MRT0-24分别为6.48±1.15和5.76±1.04h。两者的AUC0-24、AUC0-∞、Cmax具有生物等效性。Tmax经Wilcoxon sign检验，试验制剂与参比制剂在统计学上有差异（P＜0.01），试验制剂的达峰时稍晚。大鼠在体肠回流结果表明，CyA在十二指肠、空肠和回肠的吸收之间无显著性差异（P＞0.05），明显优于结肠（P＜0.01），说明CyA在小肠段吸收较好。在实验浓度范围内，药物累积吸收量与CyA浓度呈正比，说明药物吸收为被动扩散过程，提高药物在胃肠道中的溶解度有利于药物吸收。降低回流液中Na+浓度，单位面积药物的累积吸收量无显著性差异，表明药物吸收为非Na+依赖。相同浓度的新山地明与固体分散体溶液回流后，药物的累积吸收量之间无显著性差异，再次证明两种制剂的吸收程度相似。采用人肝微粒体，考察了PS对CYP1A2，CYP2A6，CYP2D6，CYP3A4各酶活性的影响，发现PS对CYP1A2，CYP2A6，CYP2D6和CYP3A4均有一定的抑制作用，且均随PS浓度的增大，抑制作用加强。抑制CYP1A2，CYP2A6，CYP2D6和CYP3A4酶活性50％所需PS的浓度(IC50)分别为0.3705，1.942，1.005和0.6585mg／mL。PS对各酶抑制作用由大至小分别为CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6和CYP2A6。表明PS在体内可能抑制CYP3A4而增加CyA的吸收。不同浓度的PS均可显著提高P-gp底物罗丹明123（R123）细胞内摄取量和肠腔侧（A侧）至基底侧（B侧）的转运量，同时显著降低R123从B侧至A侧的排放量（P＜0.05）。且均在PS为150μg／mL时作用最大。不同浓度的PS均可显著降低DPH的各向异性，增加细胞膜的流动性（P＜0.05）。且随着PS浓度的增大，对膜流动性的影响作用加强。60min后细胞膜流动性基本不再随时间而改变。去除PS后，细胞膜流动性均在30min内快速回复，表明PS是安全的，对细胞膜流动性的影响是可逆的过程，不会给细胞带来永久的损伤。PS在考察时间和考察浓度范围内均不消耗细胞内ATP，不影响P-gpATP酶活性。

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前言

Ⅰ 提高CyA口服吸收的措施

Ⅱ 肠道P-gp和CYP3A4对口服药物吸收的影响

参考文献

第一章环孢素固体分散体的制备及体外研究

1 材料和仪器

2 实验方法和内容

2.1 HPLC方法的建立与评价

2.1.1 标准曲线的制备

2.1.2 回收率试验

2.1.3 精密度试验

2.1.4 稳定性试验

2.2 CyA在不同浓度SLS中溶解度的测定及溶出介质的选择

2.3 固体分散体的制备

2.3.1 溶剂法

2.3.2 溶剂-熔融法

2.4 物理混合物的制备

2.5 溶解度实验

2.6 CyA固体分散体的物相鉴定

2.6.1 差示扫描量热分析

2.6.2 X—射线衍射分析

2.6.3 热台显微镜

2.6.4 表面形态

2.6.5 红外光谱（FTIR）

2.7 体外溶出度测定

2.8 数据处理

2相似因子法'>2.8.1 f₂相似因子法

2.8.2 平均溶出时间（MDT）

3 实验结果和讨论

3.1 HPLC方法的建立与评价

3.1.1 辅料及样品的HPLC图谱

3.1.2 标准曲线

3.1.3 回收率试验

3.1.4 精密度试验

3.1.5 稳定性试验

3.2 溶出介质的选择

3.3 固体分散体的制备

3.4 溶解度试验结果

3.5 CyA固体分散体的物相鉴定

3.5.1 差示扫描量热分析（DSC）

3.5.2 X—射线衍射图谱（PXRD）

3.5.3 热台显微镜测定结果（HSM）

3.5.4 SEM

3.5.5 FTIR

3.6 溶出度

3.6.1 以0.1%SDS为溶出介质

3.6.1.1 以PS为载体制备的固体分散体

3.6.1.2 以F127为载体制备的固体分散体

3.6.1.3 以F68为载体制备的固体分散体

3.6.1.4 以PVP为载体制备的固体分散体

3.6.2 以蒸馏水为溶出介质

3.6.2.1 以PS为载体

3.6.2.2 以F127、F68为载体

4 小结

参考文献

第二章环孢素胶囊的制备及稳定性研究

1 材料和仪器

2 实验方法和内容

2.1 固体分散体制备过程各因素对药物溶出的影响

2.2 休止角的测定

2.3 主药与辅料相互作用研究

2.4 粉末吸湿性考察

2.5 临界相对湿度（CRH）的测定

2.6 CyA胶囊的制备

2.7 CyA胶囊溶出度试验

2.7.1 HPLC方法的建立与评价

2.7.1.1 标准曲线的制备

2.7.1.2 回收率试验

2.7.1.3 精密度试验

2.7.1.4 稳定性试验

2.7.2 CyA胶囊溶出度测定方法

2.7.3 CyA溶出度均一性试验及溶出曲线

2.8 胶囊中CyA含量测定方法

2.8.1 HPLC方法的建立与评价

2.8.1.1 标准曲线的制备

2.8.1.2 精密度试验

2.8.1.3 提取回收率试验

2.9 有关物质的测定

2.9.1 色谱条件与系统适用性试验

2.9.2 有关物质的测定方法

2.10 CyA胶囊的稳定性试验

2.10.1 影响因素试验

2.10.1.1 光照试验

2.10.1.2 高温试验

2.10.1.3 高湿试验

2.10.2 加速试验

2.10.3 长期试验

2.11 X—射线衍射分析

3 实验结果和讨论

3.1 固体分散体制备各因素对药物溶出的影响

3.2 休止角的测定

3.3 主药与辅料相互作用研究

3.4 粉末吸湿性

3.5 临界相对湿度

3.6 溶出度试验中HPLC分析方法评价

3.6.1 相关图谱

3.6.2 标准曲线的制备

3.6.3 回收率试验

3.6.4 精密度

3.6.5 稳定性试验

3.7 溶出度均一性试验及溶出曲线

3.8 CyA胶囊的含量测定方法

3.8.1 相关图谱

3.8.2 标准曲线的制备

3.8.3 提取回收率试验

3.8.4 精密度试验

3.9 有关物质的测定方法

3.10 CyA胶囊的稳定性试验结果

3.10.1 影响因素试验

3.10.1.1 光照试验

3.10.1.2 高温试验

3.10.1.3 高湿试验

3.10.2 加速试验

3.10.3 长期试验

3.11 X—射线衍射分析结果

4 小结

参考文献

第三章环孢素固体分散体大鼠口服生物利用度研究

1 材料和仪器

2 实验方法和内容

2.1 血药浓度测定方法的建立与评价

2.1.1 色谱条件

2.1.2 血样处理

2.1.3 标准曲线制备

2.1.4 绝对回收率

2.1.5 方法回收率

2.1.6 日内和日间精密度

2.1.7 检测限

2.2 CyA固体分散体的大鼠口服吸收实验

2.2.1 给药与取样

2.2.2 血药浓度测定

2.2.3 药物动力学参数计算和统计处理

3 实验结果与讨论

3.1 血药浓度测定方法的建立与评价

3.1.1 空白血样及样品的HPLC图谱

3.1.2 标准曲线

3.1.3 绝对回收率

3.1.4 方法回收率

3.1.5 日内和日间精密度

?的血药浓度数据'>3.2 CyA固体分散体及Sandimmun Neoral^?的血药浓度数据

3.3 模型拟合及药动学参数

4 小结

参考文献

第四章环孢素胶囊的人体生物利用度及生物等效性试验

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 HPLC方法的建立与评价

2.1.1 色谱条件

2.1.2 CyA标准曲线工作液的制备

2.1.3 CyA质控标准工作液的制备

2.1.4 内标CyD工作液

2.1.5 标准全血样品的制备

2.1.6 人全血样品的质控标准的制备

2.1.7 标准曲线的制备

2.1.8 专一性（干扰试验）

2.1.9 最低检测限

2.1.10 准确度

2.1.11 精密度

2.1.11.1 批内精密度

2.1.11.2 批间精密度

2.1.12 提取回收率

2.1.13 稳定性

2.1.13.1 样品在全自动进样器中的稳定性

2.1.13.2 多次冻融试验

2.2 人全血样品的处理

2.3 临床试验方案

2.3.1 受试者要求

2.3.2 实验设计

2.4 药物动力学参数计算方法

2.5 统计分析方法

3 结果与讨论

3.1 HPLC分析方法的建立与评价

3.1.1 专一性

3.1.2 标准曲线

3.1.3 最低检测限（LOQ）

3.1.4 准确度

3.1.5 精密度

3.1.5.1 批内精密度

3.1.5.2 批间精密度

3.1.6 提取回收率

3.1.7 稳定性

3.1.7.1 样品在全自动进样器中的稳定性

3.1.7.2 多次冻融试验

3.2 药物浓度-时间曲线

3.3 药物动力学参数

4 小结

参考文献

第五章大鼠在体肠回流法研究环孢素的吸收行为

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 HPLC方法的建立与评价

2.1.1 标准曲线制备

2.1.2 回收率和稳定性试验

2.2 大鼠在体肠回流实验

2.2.1 实验装置

2.2.2 在体肠回流试验方法

2.2.3 数据处理

2.3 肠壁的物理吸附

2.4 CyA最佳吸收部位研究

2.5 CyA浓度对药物吸收的影响

?与CyA固体分散体在体吸收的比较'>2.6 Sandimmun Neoral^?与CyA固体分散体在体吸收的比较

+浓度的影响'>2.7 Na⁺浓度的影响

3.实验结果

3.1 CyA分析方法评价

3.1.1 相关图谱

3.1.2 标准曲线

3.2 CyA在空白肠回流液中稳定性和回收率试验

3.3 肠壁的物理吸附

3.4 CyA的最佳吸收部位

3.5 CyA浓度对药物吸收的影响

+浓度的影响'>3.6 Na⁺浓度的影响

3.7 新山地明与固体分散体中CyA的在体吸收

4 讨论

4.1 回流液中药物浓度的选择

4.2 流速的影响

4.3 小肠吸收水分的影响

4.4 管道系统对药物吸附的影响

5 小结

参考文献

第六章 PS对细胞色素P450酶活性的影响研究

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 HPLC分析方法

2.2 人肝微粒体制备

2.3 PS对人肝脏微粒体代谢的影响

2.4 统计分析

3 结果与讨论

3.1 HPLC分析方法

3.2 PS对P450酶活性的影响

3.2.1 PS对CYP1A2的影响

3.2.2 PS对CYP2A6的影响

3.2.3 PS对CYP2D6的影响

3.2.4 PS对CYP3A4的影响

4 小结

参考文献

第七章 PS对P-糖蛋白抑制作用的研究

1 材料与仪器

2 实验方法

2.1 PS临界胶束浓度的测定

2.2 R123标准曲线的制备

2.3 细胞单层培养

2.4 细胞毒性评价—MTT法

2.5 摄取实验

2.5.1 时间对R123摄取的影响

2.5.2 PS浓度和P-糖蛋白抑制剂对R123摄取的影响

2.6 转运试验

2.7 数据处理

2.8 PS对细胞膜流动性的影响

2.9 PS对细胞中ATP的影响

2.10 PS对P-gp ATP酶活性的影响

3 实验结果与讨论

3.1 PS临界胶束浓度的测定

3.2 R123标准曲线

3.3 MTT法结果

3.4 细胞摄取实验结果

3.4.1 时间对R123摄取的影响

3.4.2 PS浓度和P-糖蛋白抑制剂对R123摄取的影响

3.5 PS浓度对R123跨膜转运的影响

3.6 PS对细胞膜流动性的影响

3.7 PS对细胞内ATP的影响

3.8 PS对P-gp ATP酶活性的影响

4 小结

参考文献

全文总结

本文创新点

攻读博士期间发表论文情况

致谢

环孢素固体分散体胶囊的研制及载体促吸收机理的研究

论文摘要

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