论文摘要
为实现肉毒毒素A重链C-端结合区（BoNT/AHc-C）在原核表达系统中高效表达,对编码基因序列重新优化设计,以16条长片段寡核苷酸引物经重叠PCR合成BoNT/A Hc-C基因片段,插入表达载体pET-His,再转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS中进行诱导表达,重组蛋白约占细胞总蛋白的65%,以金属螯合亲和层析法纯化重组蛋白,然后对其进行了稀释复性,获得纯度大于95%的可溶性重组蛋白,Western印迹和间接ELISA均证明,该重组蛋白与抗天然BoNT/A马血清抗毒素有特异性结合反应。 用纯化的rBoNT/A-Hc-C免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤Sp2/O细胞融合,经间接ELISA筛选和克隆化制备杂交瘤细胞系,获得3株杂交瘤细胞株,命名为2A8、4F7和2F2,可稳定分泌单克隆抗体,IgG亚类鉴定均为IgG1,2A8可保护小鼠抵抗10 LD50 BoNT/A的攻击,以蛋白G亲和层析纯化腹水抗体,获得纯度大于95%的抗体蛋白。 为获得核糖体展示所必需的全部组件,采用重叠PCR技术合成pT7PD质粒,它可以有效的进行体外转录和体外翻译。然后,通过酶切连接引入编码随机12肽的核苷酸序列,即得到核糖体展示随机12肽库的核酸文库。对该文库进行了体外转录和体外翻译鉴定,证明其可以有效地进行体外转
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