丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A与USF2相互作用研究

论文摘要

丙型肝炎（Hepatitis C Virus, HCV）是一个全球性危害人类健康的重要病原体,感染后机体极易导致慢性肝炎,并引起肝纤维化、肝硬化、肝坏死,最终导致肝癌。目前对于丙型肝炎病毒致病机制的了解仍旧非常有限。研究发现丙型肝炎病毒的致病性除了病毒本身因素外,病毒蛋白与宿主细胞蛋白的相互作用在其中发挥重要的作用。在组成病毒的结构蛋白（Struotural Protein）口非结构蛋白中,非结构蛋白NS5A通过与细胞蛋白的相互作用在信号转导、胞内物质转运、抗细胞凋亡以及其它的一些方面发挥了重要作用,研究表明在HCV病毒感染宿主细胞后,在细胞内装配。其中NS5A中的dmainⅡ domainⅢ区域也影响了HCV的复制,并且许多相互作用的后果都能维持或促进病毒在细胞内的持续复制,但其详细机制有待进一步明确。我们通过酵母双杂交系统筛选人类肝脏cDNA文库时得知domainⅡ-Ⅲ与USF2之间有可能存在相互作用,鉴于这两种蛋白质在细胞生理功能上的重要性,我们对其相互作用做了进一步的验证,通过GST融合蛋白沉降技术、免疫共沉淀技术的结果不能证明NS5A domainⅡ-Ⅲ与USF2之间一定存在着相互作用,还需要通过进一步的研究对它进行验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的研究背景
• 1.1.1 丙型肝炎病毒介绍
• 1.1.1.1 丙型肝炎病毒的结构和特点
• 1.1.1.2 HCV病毒在肝细胞的复制过程
• 1.1.1.3 HCV基因组结构
• 1.1.2 NS5A基因的结构和定位
• 1.1.3 NS5A功能与作用
• 1.2 USF概述
• 1.2.1 USF2的结构
• 1.2.2 USF2的功能与疾病发生
• 1.2.2.1 USF2的自我剪切
• 1.2.2.2 USF2与细胞增殖
• 1.2.2.3 USF2与糖脂代谢
• 1.2.2.4 USF2与肾脏疾病
• 1.3 蛋白质相互作用
• 1.3.1 研究蛋白质相互作用的意义
• 1.3.2 研究蛋白质相互作用的方法
• 1.3.2.1 酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system,Y2H system）
• 1.3.2.2 GST融合蛋白沉降（GST Pull-Down）技术
• 1.3.2.3 免疫共沉淀（immunoprecipation）
• 1.4 研究目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株、细胞系和质粒
• 2.1.1.1 菌株
• 2.1.1.2 细胞系
• 2.1.1.3 质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂和酶
• 2.1.4 主要缓冲液
• 2.1.5 仪器和设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物序列
• 2.2.2 基因扩增体系
• 2.2.3 基因扩增条件
• 2.2.4 大肠杆菌高效率感受态细胞制备
• 2.2.5 大肠杆菌的快速转化
• 2.2.6 大肠杆菌的常规转化
• 2.2.7 质粒DNA的提取与纯化
• 2.2.7.1 碱裂解法抽提质粒DNA
• 2.2.7.2 商业化试剂盒抽提质粒DNA
• 2.2.8 质粒酶切
• 2.2.9 SDS-PAGE检测表达蛋白
• 2.2.10 免疫印记检测表达蛋白
• 2.2.11 HEK293细胞的复苏
• 2.2.12 HEK293细胞的冻存
• 2.2.13 哺乳动物细胞系HEK293的组织培养
• 2.2.14 哺乳动物细胞的转染
• 2.2.15 应用酵母双杂交筛选人类肝脏有限cDNA文库的步骤
• 2.2.15.1 有限5×cDNA文库的制备
• 2.2.15.2 酵母菌的质粒DNA的小量转化
• 2.2.15.3 酵母菌的人类肝脏cDNA文库转化
• 2.2.15.4 啤酒酵母中质粒DNA的抽提
• 2.2.15.5 一步法转化酵母
• 2.2.15.6 酵母大平板的影印
• 2.2.15.7 酵母LacZ显色
• 2.2.16 GST pull down步骤
• 2.2.17 免疫共沉淀步骤
• 3 结果与分析
• 3.1 酵母双杂交结果
• 3.1.1 NS5A domainⅡ-Ⅲ和Ⅲ自身激活作用的检测
• 3.1.2 以NS5A domainⅡ-Ⅲ和Ⅲ为“诱饵”的筛库结果
• 3.1.3 Blast序列比对结果
• 3.1.4 在二缺平板SC-Leu-Trp筛选结果
• 3.1.5 酵母LacZ显色结果
• 3.2 NS5AdomainⅡ-Ⅲ,Ⅲ和USF2全长基因的扩增
• 3.3 GST-pulldown结果
• 3.3.1 NS5AdomainⅡ-Ⅲ和Ⅲ与USF2的相互作用对GST-pull down重组质粒的构建
• 3.3.2 NS5AdomainⅡ-Ⅲ,Ⅲ与USF2的原核表达纯化结果
• 3.3.3 GST-pull down
• 3.4 免疫共沉淀验证NS5A与USF2之间的相互作用
• 4 讨论与展望
• 4.1 讨论
• 4.1.1 HCV NS5A domainⅡ-Ⅲ与USF2的相互作用
• 4.1.2 HCV NS5A domainⅡ-Ⅲ与USF2相互作用的生理意义
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢