皱纹盘鲍溶菌酶及两种蛋白酶抑制因子的克隆与表达

论文摘要

皱纹盘鲍是鲍科动物中最具经济价值的种类之一,也是我国北方一种重要的海水养殖贝类。自19世纪80年代以来,不断爆发大规模的养殖鲍死亡事件,对我国鲍养殖产业造成了巨大的损失,严重威胁到了鲍养殖产业的健康可持续发展。从鲍自身的免疫机制入手,尤其是免疫相关基因及其机制研究,深入分析了解鲍异常死亡的原因,并在此基础上寻找其疾病防治的有效方法,对皱纹盘鲍的健康养殖十分重要。动物免疫机制包括免疫识别、信号传导和免疫应答三部分,免疫应答是整个免疫防御系统的关键。研究发现,半胱氨酸蛋白酶抑制因子和丝氨酸蛋白酶抑制因子在无脊椎动物,特别是节肢动物的免疫应答中更是起着核心作用,它们的协同作用不但与信号转导和级联放大有关,还可导致特异性防御机制的激活。在无脊椎动物免疫过程中,除了免疫系统激活产生的免疫效应因子能够对侵入生物体内的各种致病的病原进行免疫杀灭作用以外,其体内的存在的溶菌酶是先天性免疫体系中非常重要的一个环节,在防御病害方面所发挥非常重要的作用。首先,本文通过RACE方法获得了皱纹盘鲍C型溶菌酶基因的cDNA全长并对其进行了序列的生物信息学分析,皱纹盘鲍HdLysC全长cDNA为586个碱基,其中开放阅读框为441个碱基,编码147个氨基酸,与无脊椎C型溶菌酶相似度在21.4到30.8%之间,与脊椎动物中C型溶菌酶的相似度在20.1到30.9%之间。在基因结构上,鲍HdLysC基因结构更接近脊椎动物。采用qRT-PCR（quantitative real time PCR）方法分析HdLysC基因在不同组织的表达情况,结果发现HdLysC基因在外套膜中表达水平最高,其次外肌肉、鳃和消化腺,而在血淋巴中的表达水平最低。鳗弧菌Vibrio angullarum感染后皱纹盘鲍鳃组织中HdLysC基因mRNA表达量表现出逐渐升高的趋势。通过构建原核表达载体,对HdLysC基因进行了体外重组表达,并对纯化的重组蛋白进行了抗菌活性实验。结果表明,重组HdLysC蛋白对革兰氏阴性菌和阳性菌都表现出一定的抗菌能力,其中对实验中使用的鳗弧菌（V.anguillarum）表现出了较强的抗菌活性。其次,采用RACE方法获得了皱纹盘鲍两种蛋白酶抑制因子cDNA全长。其中半胱氨酸蛋白酶抑制因子全长1049个碱基,其中开放阅读框（ORF）为813个碱基,编码271个氨基酸,HdCpi基因编码的氨基酸序列中具有cystatins家族的典型特征:即三个与半胱氨酸蛋白酶活性区反应的主要位点,N端的甘氨酸位点（Gly64）、Gln-X-Val-X-Gly标签序列（Q202VVAG206）和C端的色氨酸（W254）位点。丝氨酸蛋白酶cDNA全长为1446个碱基,其中开放阅读框为1230个碱基,编码410个氨基酸,其氨基酸序列结构与Serpin家族的特点相似。采用qRT-PCR（quantitative real time PCR）方法分析两种蛋白酶抑制因子基因在不同组织中的表达情况,以及鳗弧菌Vibrio angullarum感染后鳃组织的感染情况,结果表明两种基因在所有检测的组织包括外套膜、鳃、消化腺、血淋巴和肌肉中都有表达,并且HdSpi在消化腺中的表达要远远的高于其他组织。弧菌刺激后鳃组织中的两种蛋白酶抑制因子的基因的表达量都有升高的过程。另外,采用Genome-walking的方法得到了三种基因的近端启动子序列并对其进行了相关分析。结果发现三种基因的启动子序列中都发现了Oct-1, Oct-2.1, Sp1, WT1, AP-1和AP-2alph等被证明了与动物免疫和癌症发生有关的转录因子因子结合位点,进一步证实了这三种基因与鲍免疫之间的相关性。最后,采用流式细胞仪对不同温度（8℃、14℃、20℃和26℃）下长期饲养的皱纹盘鲍的细胞免疫参数进行检测。结果表明,各温度条件下饲养鲍的血细胞总数、细胞死亡率,以及不同类型血细胞百分比没有显著的差异,但20℃条件下饲养鲍的血细胞吞噬活性最强,8℃条件饲养的鲍呼吸爆发现在高于其他的组。对CAT、HdLyC、HdCpi和HdSpi免疫基因的表达进行相关分析,结果表明正常情况下,不同温度条件下鲍体内这些基因的表达量没有显著差异;受到细菌刺激后,这些基因不同温度下呈现出了不同的表达规律,进一步证实了鲍的免疫能力与温度变化有密切的关系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 无脊椎动物免疫的研究进展
• 1.1.1 无脊椎动物信号识别
• 1.1.2 病原相关分子模式
• 1.1.3 模式识别受体
• 1.1.4 免疫信号的调整和放大
• 1.1.5 无脊椎动物特异性免疫的研究
• 1.2 皱纹盘鲍免疫机制及影响因素研究
• 1.2.1 皱纹盘鲍的细胞免疫
• 1.2.2 体液免疫
• 1.3 鲍大规模死亡事件的相关研究
• 1.3.1 鲍的病原
• 1.3.2 影响鲍免疫能力相关因子的研究
• 1.4 本研究的目的及意义
• 1.4.1 本研究的目的
• 1.4.2 本研究的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物及组织收集
• 2.1.2 温度影响实验样品及处理
• 2.1.3 主要化学试剂
• 2.1.4 主要试剂的配制
• 2.1.5 实验设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 鲍总RNA 的提取
• 2.2.2 鲍DNA 的提取
• 2.2.3 感受态细胞的制备
• 2.2.4 琼脂糖凝胶纯化 PCR 产物
• 2.2.5 PCR 产物连接和转化
• 2.2.6 目的基因的生物信息学分析
• 2.2.7 实时定量 PCR 法检测目的基因的表达
• 2.2.8 染色体步移技术
• 第三章 皱纹盘鲍溶菌酶的克隆表达及其重组产物的活性研究
• 3.1 研究背景
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 皱纹盘鲍C 型溶菌酶cDNA 全长克隆
• 3.2.2 皱纹盘鲍C 型溶菌酶基因全长克隆
• 3.2.3 溶菌酶表达的实时定量PCR 检测
• 3.2.4 目的基因生物信息学分析
• 3.2.5 原核表达重组质粒构建
• 3.2.6 重组蛋白的表达与检测
• 3.2.7 重组蛋白的纯化
• 3.2.8 重组蛋白的复性
• 3.2.9 重组蛋白的浓度测定
• 3.2.10 溶菌酶酶活测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 皱纹盘鲍HdLysC 基因的cDNA 序列和推导氨基酸序列分析
• 3.3.2 HdLysC 的基因组结构和启动子序列分析
• 3.3.3 皱纹盘鲍HdLysC 基因的分子进化研究
• 3.3.4 HdLysC 基因的mRNA 在皱纹盘鲍体内的组织特异性表达
• 3.3.5 HdLysC 基因在鳗弧菌刺激后的表达规律分析
• 3.3.6 HdLysC 基因表达蛋白的表达与纯化
• 3.3.7 重组HdLysC 蛋白的活性测定
• 3.4 讨论
• 第四章 皱纹盘鲍一种半胱氨酸蛋白酶抑制因子的克隆与表达研究
• 4.1 研究背景
• 4.1.1 抗原呈递作用
• 4.1.2 cystatin 与细胞因子分泌
• 4.1.3 cystatin 与一氧化氮合成
• 4.1.4 cystatin 的免疫调节作用
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 皱纹盘鲍半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因全长克隆
• 4.2.2 皱纹盘鲍半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因全长克隆
• 4.2.3 半胱氨酸蛋白酶抑制因子表达的实时定量PCR 检测
• 4.2.4 温度对半胱氨酸蛋白酶抑制因子基因表达的影响
• 4.2.5 目的基因生物信息学分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 皱纹盘鲍半胱氨酸蛋白酶抑制因子cDNA 序列和推导氨基酸序列分析
• 4.3.2 皱纹盘鲍HdCpi 启动子序列分析
• 4.3.3 皱纹盘鲍HdCpi 基因的分子进化研究
• 4.3.4 皱纹盘鲍HdCpi 基因体内组织特异性表达
• 4.3.5 HdCpi 基因在鳗弧菌刺激后的表达规律分析
• 4.4 讨论
• 第五章 皱纹盘鲍一种丝氨酸蛋白酶抑制因子的克隆与表达研究
• 5.1 研究背景
• 5.1.1 Kazal 型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族
• 5.1.2 Kunitz 型丝氨酸蛋白酶抑制剂
• 5.1.3 Serpin 型丝氨酸蛋白酶抑制剂
• 5.1.4 α2-巨球蛋白（α2-macroglobulin）
• 5.1.5 Pacifastin 型蛋白酶抑制剂
• 5.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂在无脊椎动物免疫体系中的作用
• 5.2.1 对抗病原体蛋白酶
• 5.2.2 调节内源性蛋白酶活性
• 5.2.3 血淋巴凝结
• 5.2.4 酚氧化酶原激活
• 5.2.5 参与机体胚胎发育及抗菌蛋白的诱导表达过程
• 5.3 材料与方法
• 5.3.1 皱纹盘鲍HdSpi 基因全长克隆
• 5.3.2 皱纹盘鲍HdSpi 基因启动子序列的克隆
• 5.3.3 皱纹盘鲍HdSpi 基因表达的实时定量PCR 检测
• 5.3.4 目的基因生物信息学分析
• 5.4 结果
• 5.4.1 皱纹盘鲍HdSpi 基因cDNA 序列和推导氨基酸序列分析
• 5.4.2 皱纹盘鲍HdSpi 基因启动子序列分析
• 5.4.3 皱纹盘鲍HdSpi 基因的分子进化研究
• 5.4.4 皱纹盘鲍HdSpi 基因体内组织特异性表达
• 5.4.5 鳗弧菌刺激后皱纹盘鲍HdSpi 基因的表达规律分析
• 5.5 讨论
• 第六章 温度对皱纹盘鲍免疫能力的影响研究
• 6.1 研究背景
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 样品处理
• 6.2.2 鲍血淋巴细胞免疫学指标
• 6.2.3 流式细胞仪指标测定
• 6.2.4 免疫相关基因的表达研究
• 6.2.5 实验数据的统计分析
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 不同温度条件下皱纹盘鲍血细胞指标
• 6.3.2 不同温度条件下皱纹盘鲍血细胞吞噬能力
• 6.3.3 不同温度条件下皱纹盘鲍血细胞呼吸爆发能力
• 6.3.4 不同温度条件下皱纹盘鲍鳃组织过氧化氢酶表达比较
• 6.3.5 不同温度条件下皱纹盘鲍鳃组织溶菌酶表达比较
• 6.3.6 不同温度条件下皱纹盘鲍鳃组织HdSpi 表达比较
• 6.3.7 不同温度条件下皱纹盘鲍组织 HdCpi 表达比较
• 6.3.8 不同温度条件下皱纹盘鲍细菌刺激后组织过氧化氢酶表达比较
• 6.3.9 不同温度条件下弧菌刺激后皱纹盘鲍鳃组织 HdLys 表达比较
• 6.3.10 不同温度条件下弧菌刺激后皱纹盘鲍鳃组织 HdCpi 表达比较
• 6.3.11 不同温度条件下弧菌刺激后皱纹盘鲍鳃组织 HdSpi 表达比较
• 6.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 博士期间发表的文章
• 致谢