人脑星形细胞瘤的原代培养及其侵袭性的实验研究

论文摘要

背景和目的星形细胞瘤是脑胶质瘤中最常见的类型,占原发性中枢神经系统肿瘤的60%,每年新发病人数约为5～10人/10万。星形细胞瘤的生长方式呈侵袭性,常侵犯周围脑组织。星形细胞瘤的治疗以开颅手术切除肿瘤为主,辅助以放射治疗和化学治疗。但切除术后易复发,所以研究星形细胞瘤的侵袭性并防止术后复发便成为肿瘤治疗的重要方面。原代培养,是从供体取得离体细胞后,在体外进行的首次培养。原代培养的细胞,因组织和细胞刚刚离体,生物学性状未发生明显变化,仍具有二倍体遗传的特征,最接近体内细胞的生物学特性。本实验取人脑星形细胞瘤手术组织,经剪切、消化后,培养、传代并鉴定,同时观察细胞的生长活性,建立一种简便、易行、廉价、高效的星形细胞瘤原代细胞的培养方法,为研究星形细胞瘤的发生、发展、生物学行为及治疗提供理论基础。侵袭性是星形细胞瘤的特点之一,也是临床常规治疗难以治愈的关键所在。Boyden chamber小室侵袭实验是一种肿瘤细胞侵袭能力的体外测定方法,即在聚碳酸酯微孔滤膜上加入一定量的细胞,在有/无基底胶存在的两种情况下,分别记录细胞的穿膜个数,以观察不同级别的星形细胞瘤原代培养细胞的趋化和侵袭能力。本实验旨在研究人脑星形细胞瘤原代培养技术,通过对不同级别星形细胞瘤的培养,建立星形细胞瘤体外短期培养的方法;同时观察培养细胞生长特性和侵袭性与肿瘤级别的关系,并为星形细胞瘤的治疗及肿瘤的预后判断提供有力的实验依据。材料和方法1.取新鲜手术标本并做常规病理检查本实验取星形细胞瘤手术后的新鲜离体标本,一部分送常规病理检查,剩余大小约1cm×1cm×1cm的组织无菌包裹,送入无菌培养间培养。对用常规病理检查（HE及免疫组化）证明为星形细胞瘤的标本继续培养。2.星形细胞瘤标本的处理应用机械分散法分离细胞。用剪刀将瘤组织剪成碎块,并将组织碎块放在注射器内反复推压后取出,胰蛋白酶消化后制成细胞悬液。镜检细胞计数、接种培养。3.星形细胞瘤原代培养用上述分离方法得到的细胞,细胞悬液计数1×106/ml后,在PRMI1640培养基（加10%胎牛血清）、37℃、5%CO2条件下、培养板中培养,每隔3～4d换培养液1次;细胞长满底部70%～80%后,用0.25%胰蛋白酶消化,细胞计数,传代。继续培养,对细胞进行形态学观察、免疫细胞化学鉴定和Boyden chamber侵袭小室实验。4.细胞形态学观察用倒置相差显微镜观察活细胞的形态学和生长状态的变化,观察不同级别的星形细胞瘤形态学和生长状态的不同。5.免疫细胞化学鉴定采用SP法,检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、Ⅳ型胶原（CollagenⅣ）和巢蛋白（nestin）在原代培养细胞中的表达。6.Boyden chamber实验Boyden小室测定原代培养的Ⅲ级、Ⅳ级星形细胞瘤细胞,在相同的培养时间和培养条件下的趋化性和侵袭能力,观察两种级别的肿瘤细胞趋化性和侵袭力的差别。7.统计学处理以上结果用SPSS10.0软件进行统计处理,数据结果采用（?）±S表示,两个样本比较用t检验,以a=0.05为显著性水平。结果1.常规病理检查诊断为星形细胞瘤的手术标本22例,其中Ⅰ级（毛细胞性星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤）3例,Ⅱ级（弥漫性星形细胞瘤,包括纤维性星形细胞瘤、原浆性星形细胞瘤、肥胖细胞性星形细胞瘤）4例,Ⅲ级（间变性星形细胞瘤）7例,Ⅳ级（胶质母细胞瘤）8例;其免疫组化结果显示:胶质纤维酸性蛋白（GFAP）呈阳性。2.原代培养:应用物理和化学方法,成功地培养出星形细胞瘤原代细胞。肿瘤级别不同,细胞的生长活性不同,其中Ⅰ级星形细胞瘤接种后死亡,Ⅱ级星形细胞瘤接种后成活但不能传代。Ⅲ级、Ⅳ级星形细胞瘤可以成活并可稳定传代4～6代（约28d）。2.形态学观察:倒置显微镜下,发现细胞形态多样,大小不一;细胞呈星形、三角形、菱形或梭形。肿瘤级别越高,细胞贴壁时间越短,生长越旺盛,并呈交错性生长（细胞失去极性）。4.免疫细胞化学检查:免疫细胞化学染色法检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、Ⅳ型胶原（CollagenⅣ）、巢蛋白（nestin）在原代培养细胞中的表达。结果显示:原代培养的细胞胶质纤维酸性蛋白（GFAP）呈阳性、Ⅳ型胶原（CollagenⅣ）呈阴性,巢蛋白（nestin）阳性（Ⅳ级星形细胞瘤）。为此,结合细胞的形态、生长方式及免疫细胞化学结果,证明所培养的细胞为星形细胞瘤细胞。5.Boyden小室体外趋化和侵袭实验结果:原代培养的Ⅲ级、Ⅳ级星形细胞瘤细胞具有趋化性和侵袭性的特点;在趋化和侵袭实验中,在相同的培养时间和培养条件下,与Ⅲ级星形细胞瘤细胞相比,Ⅳ级星形细胞瘤细胞不同时间的穿膜细胞数均高于Ⅲ级星形细胞瘤细胞,其差异有统计学意义（P＜0.05）。结论1.采用物理、化学两种方法进行星形细胞瘤的原代细胞培养,建立星形细胞瘤原代培养的简便、有效的实验方法。2.形态学、免疫细胞化学证明培养的细胞是星形细胞瘤细胞。3.随着肿瘤级别增高,原代培养细胞的生物活性及增殖能力明显增加。4.培养出的Ⅲ级、Ⅳ级星形细胞瘤原代细胞可用于Boyden chamber趋化和侵袭实验。5.原代培养的瘤细胞具有趋化性和侵袭性的特点。6.在趋化和侵袭实验中,Ⅳ级星形细胞瘤趋化性和侵袭性均高于Ⅲ级星形细胞瘤。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文 人脑星形细胞瘤的原代培养及其侵袭性的实验研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 综述一 脑胶质瘤原代细胞的分离与培养
• 参考文献
• 综述二 脑胶质瘤侵袭性机制的研究进展
• 参考文献
• 在读硕士期间发表的文章
• 英文缩略词表
• 致谢