酿酒酵母sam2基因在雅致放射毛霉中的克隆表达及其SAM合成工艺的优化

论文摘要

S-腺苷甲硫氨酸作为一种辅因子参与多种生化代谢反应,在生物体内具有转甲基、转硫和转氨丙基作用。SAM可用于治疗肝部疾病、抑郁症、关节炎等多种疾病,因此具有广阔的应用市场。本论文内容包括S-腺苷甲硫氨酸检测方法的建立、酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶sam2基因在雅致放射毛霉中的克隆表达、响应面法优化重组雅致放射毛霉的SAM合成工艺。综述S-腺苷甲硫氨酸的结构、性质、生理作用及其在临床上的应用,并阐述S-腺苷甲硫氨酸制备方法的研究进展。通过对电泳缓冲液、电泳的电压及时间的考察,得到纸电泳最佳条件为：Na2HPO4/柠檬酸缓冲液（0.05 mol/L, pH 7.0）,上样量10μL稳压300 V,电泳30 min,电泳结束后将斑点处纸条剪成细条,在pH1.0的HC1溶液中30℃摇床中浸提4 h,最后测定浸提液OD254,计算得到SAM浓度。此方法简便易行,但检出限较高。HPLC法的最佳条件为：Inertsil ODS-SP柱（5μm,4.6×250 mm）,15%甲醇-85%缓冲液（含0.6%乙酸铵、0.01%辛烷磺酸钠的水溶液）,用甲酸调至pH 3.0,以峰面积值代入标准曲线,获得SAM浓度。此方法灵敏、精确,其检出限可达到1.0μg/L。利用PCR技术扩增酿酒酵母sam2基因,克隆得到重组表达载体pCB 1004-PgpdA-sam2,在PEG-CaCl2介导下转化雅致放射毛霉原生质体,获得SAM高产工程菌,其SAM产量由0.3947 g/L提高至0.7744g/L,提高了96.20%。通过响应面法优化SAM高产工程菌的SAM合成工艺,确定了最佳反应条件：反应温度为37℃,pH为6.0；最佳反应体系为：葡萄糖80 g/L、二甲苯0.4%、K2HPO466.16 g/L、MgSO41.71 g/L、腺嘌呤3.91g/L和L-Met8.37g/L。SAM产量由优化前的0.75 g/L提高至1.1823g/L,提高了57.64%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语
• 第一章 文献综述
• 1.1 S-腺苷甲硫氨酸的结构
• 1.2 SAM的稳定性
• 1.2.1 SAM的降解机理
• 1.2.2 SAM失活反应的影响因素
• 1.3 SAM的生理作用
• 1.3.1 转甲基作用
• 1.3.2 转硫作用
• 1.3.3 转氨丙基作用
• 1.4 SAM的临床应用
• 1.4.1 肝部疾病
• 1.4.2 抑郁症
• 1.4.3 关节炎
• 1.4.4 其他
• 1.5 SAM的制备方法
• 1.5.1 化学合成法
• 1.5.2 酶促转化法
• 1.5.3 微生物发酵法
• 1.6 ATP概述
• 1.7 小结
• 1.8 选题意义、技术路线、研究内容及目标
• 1.8.1 选题意义
• 1.8.2 技术路线
• 1.8.3 研究内容
• 1.8.4 研究目标
• 参考文献
• 第二章 S-腺苷甲硫氨酸检测方法的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试剂与材料
• 2.2.2 仪器与设备
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 方法
• 2.2.5 溶液配制
• 2.2.6 纸电泳检测法建立
• 2.2.7 HPLC法建立
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 纸电泳方法建立
• 2.3.2 HPLC法确定
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 酿酒酵母S-腺苷甲硫氨酸合成酶sam2基因在雅致放射毛霉中的克隆表达
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 仪器设备
• 3.2.5 溶液配制
• 3.2.6 sam2基因的获得
• 3.2.7 重组表达质粒的构建
• 3.2.8 表达质粒转化雅致放射毛霉
• 3.2.9 SAM高产转化子筛选及鉴定
• 3.2.10 SAM高产转化子的遗传稳定性考察
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 sam2基因的获得
• 3.3.2 T质粒克隆
• 3.3.3 重组表达质粒的双酶切鉴定
• 3.3.4 原生质体制备与再生
• 3.3.5 SAM高产转化子的筛选与鉴定
• 3.3.6 SAM高产转化子遗传稳定性考察
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 响应面法优化重组雅致放射毛霉的SAM合成工艺
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 仪器与设备
• 4.2.4 培养基
• 4.2.5 菌体的获得
• 4.2.6 反应体系和反应条件
• 4.2.7 产物分析及计算方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 单因素试验
• 4.3.2 Plackett-Burman试验
• 4.3.3 最陡爬坡试验
• 4.3.4 转化条件的响应面优化
• 4.3.5 验证试验
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 攻读硕士学位期间主要科研成果