论文题目: 基因工程人组织激肽释放酶原的细胞表达、分离纯化及应用研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 分析化学
作者: 杨青
导师: 张玉奎
关键词: 组织激肽释放酶,细胞培养,分离纯化
文献来源: 中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）
发表年度: 2005
论文摘要: 人组织激肽释放酶是一种丝氨酸蛋白酶。它在人体内重要的生理作用说明它有可能成为治疗肾脏病的有效药物。此外,它在血液中的含量与缺血性脑中风的相关性研究显示它可以作为该疾病体外诊断的重要指标。本论文选用Sf-9及Hi-5两种昆虫细胞为载体,用基因工程的手段表达制备了人组织激肽释放酶原。对两种昆虫细胞的无血清适应及悬浮适应条件进行了系统研究,将基因工程人组织激肽释放酶原的表达量提高到25mg/L。对载有人组织激肽释放酶cDNA的CHO细胞进行了无血清悬浮适应。采用色谱技术对细胞表达产物进行了分离纯化。探讨了不同流动相组成、pH值、离子强度以及分离介质的影响。分离纯化后的样品经检测为纯品,分子量约为40961Da,回收率约为57%。对检测未知样本中组织激肽释放酶含量的ELISA方法进行了系统优化。开发了缺血性脑中风早期诊断试剂盒。考查了试剂盒的各种指标,并将其用于660例健康人及21例脑中风患者血液中组织激肽释放酶含量的检测。此外,与大连医科大学附属二院合作,用分离纯化后得到的人组织激肽释放酶原对糖尿病肾病大鼠进行了实验。结果显示,组织激肽释放酶对肾脏具有较好的保护作用。
论文目录:
摘 要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 组织激肽释放酶
1.2 组织激肽释放酶家族及其基因位点和结构特点
1.3 组织激肽释放酶的表达及调控
1.4 组织激肽释放酶的生物化学及物理化学特点
1.5 组织激肽释放酶-激肽系统（KKS）
1.6 组织激肽释放酶与疾病的关系
1.6.1 组织激肽释放酶对血压和心率的影响
1.6.2 组织激肽释放酶对心脏和血管形态功能的影响
1.6.3 组织激肽释放酶与肾脏功能衰竭
1.6.4 组织激肽释放酶与缺血性脑中风
1.7 组织激肽释放酶的基因克隆与表达
1.8 组织激肽释放酶的分离纯化
1.8.1 蛋白质规模化分离、小分子分离和蛋白质分析的区别
1.8.2 径向色谱技术
1.8.3 基因工程人组织激肽释放酶的分离纯化
1.8.4 组织激肽释放酶的鉴定
1.9 人组织激肽释放酶的研究现状
本论文主要工作
参考文献
第二章 用于病毒扩增和蛋白表达的昆虫细胞培养
2.1 引言
2.2 Sf-9 细胞的培养
2.2.1 仪器与材料
2.2.2 实验方法
2.2.2.1 玻璃器皿的无菌处理
2.2.2.2 HyQ CCM_3 培养基的配制
2.2.2.3 培养基的除菌
2.2.2.4 细胞计数方法
2.2.3 实验方法及结果
2.2.3.1 Sf-9 细胞的复苏
2.2.3.2 Sf-9 细胞的冻存
2.2.3.3 Sf-9 细胞的贴壁培养
2.2.3.4 Sf-9 细胞的无血清适应
2.2.3.5 Sf-9 细胞的悬浮适应
2.3 Hi-5 细胞的培养
2.3.1 仪器与材料
2.3.2 实验方法与结果
2.3.2.1 Hi-5 细胞的复苏及冻存
2.3.2.2 Hi-5 细胞的有血清及无血清贴壁培养
2.3.3 Hi-5 细胞的悬浮培养
2.4 CHO 细胞的培养
2.4.1 材料与仪器
2.4.2 实验方法
2.4.2.1 培养基的配制与除菌
2.4.2.2 CHO 细胞的复苏
2.4.2.3 CHO 细胞的冻存
2.4.3 实验结果与讨论
2.4.3.1 CHO 细胞的贴壁培养
2.4.3.2 CHO 细胞的悬浮培养
2.5 本章小结
参考文献
第三章 杆状病毒的扩增及重组人组织激肽释放酶原的表达
3.1 引言
3.2 重组杆状病毒的扩增
3.2.1 仪器与试剂
3.2.2 实验方法
3.2.2.1 空斑试验
3.2.2.2 重组杆状病毒的筛选和纯化
3.2.2.3 重组杆状病毒的扩增
3.2.2.3.1 重组杆状病毒的初步扩增
3.2.2.3.2 重组杆状病毒的再扩增
3.2.3 实验过程及结果
3.2.3.1 重组杆状病毒的扩增
3.2.3.1.1 重组杆状病毒的初步扩增
3.2.3.1.2 重组杆状病毒的再扩增
3.3 重组人组织激肽释放酶原的表达
3.3.1 仪器与试剂
3.3.2 实验方法
3.3.2.1 ELISA 试验
3.3.2.2 SDS-PAGE 测定
3.3.3 实验过程与结果
3.3.3.1 贴壁生长细胞的感染
3.3.3.2 悬浮生长细胞的感染
3.3.3.3 接种密度及 MOI 对重组人组织激肽释放酶原表达量的影响
3.3.3.4 有血清和无血清培养上清液比较
3.4 本章小结
参考文献
第四章 基因工程人组织激肽释放酶原的分离纯化及表征
4.1 引言
4.2 仪器与试剂
4.3 实验方法
4.3.1 DEAE－Sepharose FF 径向柱的填装
4.3.2 Phenyl-Sepharose 6B、Sephacryl S-200 柱的填装
4.3.3 Bio-HUK IgG 的制备
4.4 结果与讨论
4.4.1 DEAE-Sepharose FF 分离条件的影响
4.4.1.1 洗脱模式的影响
4.4.1.1.1 线性梯度洗脱
4.4.1.1.2 台阶梯度分离
4.4.1.2 不同缓冲液体系对分离的影响
4.4.1.2.1 NaAc 缓冲体系
4.4.1.2.2 PBS 缓冲体系
4.4.1.3 pH 值对蛋白回收的影响
4.4.2 Phenyl-Sepharose 6B 疏水层析
4.4.3 Sephacryl S-200 分子筛色谱分离
4.5 proHUK 的检测
4.5.1 proHUK 的回收率测定
4.5.2 proHUK 的SDS-PAGE 检测
4.5.3 HPLC 纯度检测
4.5.4 CIEF 检测
4.5.5 HPLC-ESI-MS 检测
4.5.6 氨基酸序列测试
4.5.6.1 氨基酸含量测试结果
4.5.6.2 N 端氨基酸测试结果
4.6 本章小结
参考文献
第五章 基于人组织激肽释放酶的缺血性脑中风早期诊断试剂盒的研究
5.1 引言
5.1.1 开发脑中风早期诊断试剂盒的意义
5.1.2 组织激肽释放酶与缺血性脑中风的相关性
5.1.3 试剂盒原理
5.2 人组织激肽释放酶酶联免疫吸附试验检测方法的优化
5.2.1 仪器与试剂
5.2.2 实验过程
5.2.2.1 人组织激肽释放酶标准品的制备
5.2.2.2 生物素标记的组织激肽释放酶抗体的制备
5.2.2.3 人组织激肽释放酶特异性免疫吸附反应试验
5.2.3 实验结果
5.2.3.1 检测的线性范围、检测限及底物的选择
5.2.3.2 底物反应终止时间的测定
5.2.3.3 检测的精密度及准确度
5.2.3.3.1 板内精密度
5.2.3.3.2 板间精确度
5.2.3.3.3 检测的准确性
5.3 缺血性脑中风早期诊断试剂盒
5.3.1 材料与试剂
5.3.2 剂盒的装配工艺
5.3.2.1 试剂盒组成
5.3.2.2 试剂盒组装过程
5.3.3 试剂盒的稳定性试验
5.3.3.1 37℃稳定性实验
5.3.3.1.1 吸光度值及线性关系
5.3.3.1.2 37℃存放72 小时后试剂盒的板内精密度与准确性
5.3.3.2 4℃稳定性实验
5.3.3.2.1 吸光度值及线性关系
5.3.3.2.2 4℃存放试剂盒的板内精密度与准确性
5.4 试剂盒的应用
5.5 本章小结
参考文献
附录 重组人组织激肽释放酶原的动物实验
作者简介及发表文章
致谢
发布时间: 2007-03-13
参考文献
- [1].组织激肽释放酶对离体缺血/缺氧性损伤的影响及其机制研究[D]. 刘玲.复旦大学2009
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