二硫键稳定单链抗体B3（ds-scFv）靶向超抗原SEA的制备及活性鉴定

论文摘要

超抗原（supperantigen SAg）的概念由White 等于1989 年首先提出,它是由一组细菌或病毒编码的蛋白分子可不需要抗原提呈细胞（APC）处理,以完整的蛋白质分子形式直接与APC 膜上的MHCⅡ类分子抗原结合槽外侧结合,导致带有特异性Vβ节段T 细胞大量活化增殖,其活化的T 细胞数是普通抗原数千倍乃至数万倍。由于它产生的杀伤性很强的细胞毒T 细胞（CTL）对肿瘤极其强大的杀伤作用,因此,超抗原作为强大的T 细胞激活剂,有可能成为新一代抗肿瘤免疫分子,给肿瘤的治疗带来新的突破。近年来,超抗原理论得到迅猛发展,已成为肿瘤免疫治疗新的热点。葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal enterotoxin A SEA）是金黄色葡萄球菌的产物,是近年来研究较多的一种细菌性超抗原。但是,SEA 激活的T 细胞所介导的细胞毒作用在对肿瘤细胞进行杀伤的同时对正常细胞也具有毒性,并且只能对MHCII+的肿瘤分子进行杀伤。因此,利用基因工程抗体对超抗原进行靶向,减少其副作用具有良好的应用前景,成为利用超抗原进行肿瘤免疫治疗的新的研究热点。为了提高单链抗体的稳定性,改善导向效果,本研究在B3 单链抗体（来源于一种肿瘤相关抗原对应的单抗）中引入了一对链间二硫键构建了二硫键稳定单链抗体B3ds-scFv,通过重叠PCR 连接B3 抗体的VH 和VL 片段,并将PCR 产物克隆至pET22b表达载体（B3ds-scFv-pET22b）;将测序正确的SEA 基因片段经酶切连接亚克隆至B3ds-scFv-pET22b 表达载体,重组表达载体经酶切鉴定两片段连接正确;转化BL21（DE3）后经IPTG 诱导表达,将表达的包涵体进行变性、复性,并用阳离子柱SP-Sepharose 将复性产物进行了初步纯化,ELISA 测定此融合蛋白中抗体部分的结合活性以及其在37℃的稳定性,并采用MTS 法检测其对B3 抗原表面阳性细胞HT-29 的杀伤作用。经鉴定,重叠PCR 扩增得到了B3ds-scFv 抗体基因,并通过酶切连接成功融合了B3ds-scFv 和SEA（D227A）两段基因,成功构建了B3ds-scFv-SEA（D227A）-pET表达载体,诱导表达产物以包涵体形式存在,占总蛋白量的33%左右;复性后的B3ds-scFv-SEA（D227A）保持了良好的抗原结合活性,并可成功杀伤人结肠癌细胞;在37℃及不同的温度下孵育一定时间后,经ELISA 测定,37℃孵育一周蛋白仍能保持活性基本不变。本研究首次成功构建了B3ds-scFv-SEA（D227A）重组毒素,此蛋白具备了导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能,并且通过链间二硫键的引入大大提高了整个融合蛋白的稳定性,为其发展为有效的肿瘤免疫治疗靶向药物奠定了基础。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 1.1 超抗原简介
• 1.2 超抗原的抗肿瘤作用机制
• 1.2.1 SDCC 作用
• 1.2.2 细胞因子的作用
• 1.2.3 LAK 细胞样细胞毒活性作用
• 1.3 超抗原抗肿瘤研究
• 1.4 单纯超抗原抗肿瘤存在的问题
• 1.5 单克隆抗体与超抗原的结合
• 1.6 基因工程抗体靶向超抗原的抗肿瘤作用
• 1.6.1 Fab-SEA 的抗肿瘤作用
• 1.6.2 单链抗体-超抗原融合蛋白抗肿瘤
• 1.6.3 突变的SEA 在肿瘤导向治疗中的应用
• 1.7 其他形式的超抗原融合蛋白
• 1.8 小结
• 1.8.1 抗体分子
• 1.8.2 抗体与效应蛋白超抗原的连接
• 1.8.3 效应分子-超抗原的安全性
• 第二部分 实验部分
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 寡聚核苷酸引物的设计及合成
• 2.2.2 B3VH 和B3VL 的扩增
• 2.2.3 以柱离心式DNA 纯化试剂盒纯化回收PCR 产物
• 2.2.4 B3VH 和B3VL 的PCR 连接
• 2.2.5 B3ds-ScFv 重组克隆质粒的构建
• 2.2.6 B3ds-ScFv 重组克隆质粒的筛选及鉴定
• 2.2.7 B3ds-ScFv-PET 重组质粒的构建
• 2.2.8 B3ds-ScFv-PET 重组质粒的筛选及鉴定
• 2.2.9 SEA（D227A）-T 的构建
• 2.2.10 序列分析
• 2.2.11 B3dsscFv-SEA-pET 表达载体的构建
• 2.2.12 B3dsscFv-SEA-pET 表达载体的筛选及鉴定
• 2.2.13 B3ds-scFv-SEA 融合蛋白的诱导表达
• 2.2.14 目的蛋白的 SDS-PAGE 鉴定
• 2.2.15 表达产物的 western blot 鉴定
• 2.2.16 包涵体的洗涤及变复性
• 2.2.17 复性产物的纯化
• 2.2.18 纯化蛋白的定量
• 2.2.19 复性后蛋白二硫键形成鉴定
• 2.2.20 ELISA 鉴定 B3ds-scFv-SEA 中抗体的活性
• 2.2.21 融合蛋白稳定性实验
• 2.2.22 MTS 法测定复性纯化后的 B3dsscFv-SEA 对肿瘤细胞的杀伤活性
• 2.3 结 果
• 第三部分 本研究的特色、意义及所取得的主要结果
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介