两种麦蚜乙酰胆碱酯酶的分子生物学研究

论文题目: 两种麦蚜乙酰胆碱酯酶的分子生物学研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 农业昆虫与害虫防治

作者: 陈茂华

导师: 韩召军

关键词: 禾谷缢管蚜,麦长管蚜,萝卜蚜,甘蓝蚜,技术,乙酰胆碱酯酶,抗药性,点突变,分子进化

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7)是维持神经系统正常功能的重要酶类，也是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标，多年来一直是农药毒理学研究的重点之一。2002年本实验室首次在同种昆虫体内发现了两个AChE基因，其中一个为黑腹果蝇AChE的直向同源基因(orthologous gene，Ⅱ型)，另一个为黑腹果蝇AChE的共生同源基因(paralogous gene，Ⅰ型)，自此，昆虫两个AChE的研究成为各国昆虫毒理学家研究的热点之一。昆虫体内两个AChE的存在为分子毒理学研究揭开了一个崭新的领域，究竟哪些昆虫具有两个AChE基因?这两个AChE基因各自又具有什么生理功能?它们的毒理学特性有何差异?它们是如何进化的?阐明这些问题可以为害虫抗药性治理和开发高选择性杀虫剂提供毒理学依据，本研究在国家自然科学基金项目《蚜虫乙酰胆碱酯酶的分子进化和毒理学特性研究》(项目编号：30370943)的资助下，以不同蚜虫为材料，开展了这方面的相关研究，取得了如下结果： 一、确定了禾谷缢管蚜和麦长管蚜体内都存在两种不同的AChE基因 通过比较已发表的昆虫AChE基因氨基酸序列，利用保守序列设计简并引物，利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术，从禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi(Linnaeus)和麦长管蚜Sitobion avenae(fabricius)中皆成功地克隆出了两种AChE的cDNA片段，分别命名为Rp.ace1、Rp.ace2和Ma.ace1、Ma.ace2。同源性分析表明，Rp.ace1、Ma.ace1与其它昆虫Ⅰ型AChE基因(Ace1)序列相同区域相似性在95％以上，Rp.ace2和Ma.ace2与其它昆虫Ⅱ型AChE(Ace2)基因序列相同区域相似性在96％以上，而Rp.ace1和Rp.ace2，以及Ma.ace1和Ma.Ace2的相似性均低于50％，说明禾谷缢管蚜和麦长管蚜体内都存在两种不同的AChE基因。 二、克隆获得了禾谷缢管蚜和麦长管蚜体内两种不同AChE的全基因 根据已经获得的cDNA片段设计特异引物，采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)，成功的从禾谷缢管蚜和麦长管蚜中克隆到两种AChE的全基因，分别命名为Rp.Ace1(GenBank登录号：AY667435)、Rp.Ace2(AY707318)、和Ma.Ace1

论文目录:

中文摘要

英文摘要

引言

第一章 文献综述

1.1 胆碱酯酶概述

1.2 ACHE的高级结构及底物结合相关位点

1.2.1 ACHE高级结构

1.2.2 ACHE高级结构中影响底物结合的相关位点

1.2.2.1 代谢三联体

1.2.2.2 酰基口袋

1.2.2.3 胆碱结合亚部位

1.2.2.4 外周阴离子部位

1.2.2.5 氧负离子孔

1.3 生物体内多个胆碱酯酶基因的存在

1.3.1 高等动物的ACHE和BUCHE

1.3.2 文昌鱼中两个胆碱酯酶基因的存在

1.3.3 线虫体内多个ACHE基因的存在

1.3.3.1 非寄生性线虫体内多个ACHE基因的存在

1.3.3.2 寄生性线虫体内多个ACHE基因的存在

1.3.4 微小牛蜱体内多个ACHE基因的存在

1.3.5 昆虫体内多个ACHE基因的存在

1.3.5.1 果蝇体内只存在一个ACHE基因

1.3.5.2 几种蚊类体内存在两个ACHE基因

1.3.5.3 蚜虫体内两个ACHE基因的研究

1.3.5.4 其他农业害虫体内可能存在两个ACHE基因

1.4 ACHE与昆虫抗药性的关系

1.4.1 ACHE的动力学参数

1.4.2 ACHE量变与昆虫抗药性的关系

1.4.3 ACHE基因点突变与昆虫(螨)抗药性的关系

1.4.3.1 Ⅱ型ACHE与昆虫(螨)抗药性相关的突变位点

1.4.3.2 Ⅰ型ACHE与昆虫(螨)抗药性相关的突变位点

第二章 禾谷缢管蚜、麦长管蚜乙酰胆碱酯酶基因CDNA片段的克隆与序列分析

2.1 材料与方法

2.1.1 供试禾谷缢管蚜和麦长管蚜

2.1.2 主要试剂和仪器

2.1.3 总RNA的提取

2.1.4 单链CDNA的合成

2.1.5 PCR反应

2.1.6 PCR产物克隆与测序

2.1.7 感受态大肠杆菌细胞的制备

2.1.8 连接反应及连接产物的转化

2.1.9 质粒DNA测序

2.1.10 序列分析

2.2 结果与分析

2.2.1 禾谷缢管蚜和麦长管蚜ACHE基因的克隆

2.2.2 序列同源性分析

2.3 讨论

第三章 禾谷缢管蚜、麦长管蚜两种乙酰胆碱酯酶基因CDNA全序列的克隆与序列分析

3.1 材料与方法

3.1.1 试虫

3.1.2 主要试剂和仪器

3.1.3 RNA提取及CDNA第一链的合成

3.1.4 PCR反应

3.1.4.1 PCR引物设计

3.1.4.2 PCR反应条件及体系

3.1.4.3 PCR产物回收与纯化

3.1.5 感受态大肠杆菌的制备及连接反应与连接产物的转化

3.1.7 序列分析

3.2 结果与分析

3.2.1 禾谷缢管蚜麦长管蚜两个ACHE基因CDNA及其推导氨基酸序列

3.2.2 禾谷缢管蚜和麦长管蚜两个ACHE基因氨基酸序列同源性分析

3.3 讨论

第四章 乙酰胆碱酯酶变异对禾谷缢管蚜和麦长管蚜

4.1 材料与方法

4.1.1 供试昆虫

4.1.2 供试药剂

4.1.3 生物测定

4.1.4.生化测定方法

4.2 结果与分析

4.2.1 禾谷缢管蚜和麦长管蚜抗性品系生物测定结果

4.2.2 抗性品系禾谷缢管蚜和麦长管蚜的酯酶活力变化

4.2.3 抗性品系禾谷缢管蚜和麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶活性测定活力变化

4.2.4 抗性品系禾谷缢管蚜和麦长管蚜ACHE生化特性的变化

4.2.5 杀虫剂对抗、感禾谷缢管蚜和麦长管蚜ACHE的抑制能力

4.3 讨论

第五章 抗性品系禾谷缢管蚜和麦长管蚜乙酰胆碱酯酶基因的点突变分析

5.1 材料与方法

5.1.1 试虫

5.1.2 主要试剂和仪器

5.1.3 RNA提取及CDNA第一链的合成

5.1.4 引物设计与合成

5.1.5 PCR扩增、产物克隆与测序

5.1.6 序列分析

5.2 结果与分析

5.3 讨论

5.3.1 禾谷缢管蚜和麦长管蚜点突变分析

5.3.2 关于昆虫ACHE基因突变

5.3.2.1 关于G227位点突变

5.3.2.2 关于F290位点突变

5.3.2.3 关于Ⅰ型ACHE基因G119位点突变

5.3.2.4 关于Ⅰ型ACHE基因的F331位点突变

5.3.2.5 关于蚜虫Ⅰ型ACHE基因的S431F和A302S突变

5.3.3 抗性品系ACHE基因不存在保守突变原因分析

5.3.4 关于蚜虫Ⅰ型及Ⅱ型ACHE基因功能的初步推测

第六章 两个乙酰胆碱酯酶基因在蚜虫中普遍

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论

第七章 乙酰胆碱酯酶基因分子进化分析及起源假说

7.1 材料与方法

7.1.1 胆碱酯酶基因氨基酸序列

7.1.2 胆碱酯酶分子系统树的构建

7.2 结果与分析

7.3 讨论

7.3.1 关于昆虫两个ACHE基因的起源

7.3.2 关于昆虫两个ACHE基因的功能

7.3.2.1 关于脊椎动物BUCHE基因的功能

7.3.2.2 关于昆虫两个ACHE基因的功能

7.3.3 关于其他酶在有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂抗性中的作用

全文总结

参考文献

致谢

附录

发布时间: 2006-10-20

参考文献

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