论文摘要
神经营养因子（NGF）是生长因子家族中最先被发现并且被深入研究的一类生长因子。它对神经系统中神经元的发育、分化、再生、功能特性的表达、突触定向生长以及可塑性方面均具有重要的调控作用。此外,它们在非神经系统尤其是肿瘤方面也发挥重要作用。例如,NGF在乳腺癌和前列腺癌样本中的高表达能够促进细胞的有丝分裂。尽管经历了大半个世纪的研究,仍有大量的学者投入到这一课题,旨在逐步揭开其极复杂的信号转导机制。NGF通过与两种受体蛋白结合传导信号,一种是对NGF有低亲和力的受体p75NTR,它是肿瘤坏死因子受体家族中的一员,能以相同的亲和力与神经营养因子家族的其他成员结合,另一种是对NGF具有高亲和力的酪氨酸激酶受体TrkA。有研究报道,在细胞膜表面,p75NTR和TrkA在膜窖（Caveolae）这一富含胆固醇,鞘脂类和窖蛋白的区域富集。Caveolae被证实与受体内吞,信号转导以及肿瘤发生等多种细胞生命活动相关。窖蛋白-1（Cav-1）是Caveolae的主要组成蛋白,它们可以在Caveolae中富集多种信号分子,抑制或者影响它们的活化,从而起到调控信号通路的作用。窖蛋白-2（Cav-2）,同样是Caveolae的主要组成蛋白,但人们对它在信号通路中的作用却知之甚少。本论文主要研究Cav-1和Cav-2对NGF信号通路的影响,从而揭示可能的膜微环境对信号通路的调控机制。信号内吞体假说提出,NGF诱导的细胞分化需要TrkA内化到内吞囊泡,并在那里经由小G蛋白Rap-1介导引发MAPK的持续活化。我们研究发现利用电转技术在小鼠背根神经节细胞瞬时表达Cav-1能显著抑制神经纤维生长。在PC12细胞内,我们建立稳定过表达Cav-1或者Cav-2的单克隆细胞系,利用免疫荧光标记显示,过表达的Cav-1和Cav-2分别主要聚集在细胞膜表面以及高尔基体。在NGF作用下,Cav-1 PC12细胞不表现明显分化,并且与细胞周期相关的抗有丝分裂的p21waf/CIPl蛋白表达受到抑制,但这些反应并不通过直接阻断丝裂原蛋白活化激酶（MAPK）磷酸化实现。利用受体荧光标记及脂筏抽提等技术,我们观察到在NGF作用下,野生型PC12细胞的NGF受体会脱离脂筏发生内化,但是在Cav-1 PC12细胞中,这一现象发生抑制,大部分NGF受体被钳制于脂筏内,其下游信号因子直至核糖体S6蛋白激酶-2（Rsk2）也被锚钉于细胞膜上,导致其无法内化至细胞核活化重要的转录因子cAMP反应原件结合蛋白（CREB）,由此最终抑制了与生长分化相关基因的表达。与此相反,过表达Cav-2却能加强NGF的诱导分化作用,同时保持正常的受体内化过程,并能维持更长时间的下游信号的活化。综合以上结果,我们认为Cav-1和Cav-2蛋白在细胞内的不同定位,创造并改变了受体的微环境,从而使Cav-1和Cav-2PC12细胞在NGF作用下表现出完全不同的应答。此外,有研究显示,Cav-1蛋白氨基酸80位上的丝氨酸突变与肿瘤发生相关,过表达Cav-1 S80V（蛋白丝氨酸80位点上缬氨酸突变）与Cav-1不同,并不抑制NGF引发的TrkA的转运和信号通路,而是表现了与Cav-2 PC12类似的应答反应。以上的这些结果强调了细胞膜微环境对于招募活化信号分子从而调控信号通路所起的重要作用。我们的研究将为TrkA和Cav-1交互作用在其他的模型,例如肿瘤形成,中提供更好的理论基础。
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