家族性急性髓系白血病cDNA消减文库的构建和差异表达基因的克隆、筛选及序列分析

论文摘要

白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤。白血病的发生是一个涉及多基因、多阶段的复杂过程,因此,全面分离与分析参与白血病发生的生物活性物质,揭示这些生物活性物质的功能与途径,对于系统研究与阐明白血病发生的分子机制尤为重要。遗传家系为我们提供了很好的样本来源,是获得疾病相关致病基因的一条重要途径。【目的】分离家族性急性髓系白血病患者骨髓中差异表达的基因,在基因水平上探讨急性白血病发生发展的分子机制。【方法】采用Super SMART和SSH 技术,以患者骨髓作为Tester,正常人骨髓作为Driver,分离患者骨髓细胞中差异表达的基因片段;连接T 载体,转化宿主菌,构建家族性急性髓系白血病cDNA 抑制性消减文库;采用DIG 标记探针的改良Differential Screening技术进行筛选和鉴定;阳性克隆送交测序,BLAST 同源性比对分析,新基因片段提交GenBank。【结果】成功构建了家族性急性髓系白血病cDNA 抑制性消减文库,巢式PCR 进一步使差异表达基因得到了指数扩增。产物连接载体并成功转化TOPO10F’大肠杆菌感受态细胞,使文库中的差异表达基因得到分离。经Differential Screening 技术筛选鉴定,确认28 个基因为阳性差异表达基因。测序结果提交GenBank 进行同源性比对分析,其中17 条与已知基因同源,11 条为未知基因片段。【结论】1. SSH 技术是筛选差异表达基因的有效方法。2. 采用DIG 标记探针替代同位素P32-dCTP 标记探针,除继承了其高度灵敏度和良好的特异性之外,还避免了放射性污染,简化了实验操作。3. 获得多个与细胞增殖和分化相关的基因,说明急性白血病的发生是一个涉及多基因、多阶段发生的复杂过程。4. 获得11 条在文库中差异表达的新基因EST 片段,并被GenBank 收录,登录号分别为CX129926-7,CV884199,CV884202-3,CV973096-101。

论文目录

• 一、论文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 第一部分:家族性急性髓系白血病差异表达基因消减cDNA 文库的建立
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• （五） 第二部分:cDNA 消减文库的克隆、筛选、鉴定及序列同源性分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• （六） 结论
• （七） 参考文献
• （八） 致谢
• 二、文献综述
• （一） 正文
• （二） 参考文献