核苷（酸）类似物相关HBV逆转录酶耐药突变的焦磷酸测序及个体化治疗

论文摘要

背景：慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB;慢乙肝）及其肝硬化是严重损害人类健康的常见传染病。循证医学资料证明,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是疾病进展的最重要的因素,故抗病毒治疗是慢乙肝治疗的关键。目前国际公认的两类有效抗病毒药物是干扰素（interferon, IFN）和核苷（酸）类似物（nucleos（t）ide analogues, NA）。后者包括拉米夫定（lamivudine, LAM）、阿德福韦酯（adefovir dipivoxil, ADV）、恩替卡韦（entecavir, ETV）、替比夫定（telbivudine, LdT）及替诺福韦（tenofovir disoproxil, TDF）（前4种已被我国SFDA批准）。NA具有显著的抑制HBV复制的作用；然而肝细胞中共价环状闭合DNA （cccDNA）的持续存在,决定了CHB需长期治疗。而随着用药时间的延长,HBV可能会发生NA相关的耐药突变,从而可导致肝炎发作,甚至肝衰竭和死亡,因而NA相关HBV耐药突变是一重要的临床问题。定期监测耐药、早期发现耐药相关突变并给予有效的挽救治疗对于疾病的控制具有重要意义。在NA耐药的监测中,血清HBV DNA是最重要的监测指标；但血清HBV DNA水平除受NA耐药影响外,还与患者依从性、药物代谢以及体内病毒的自然波动等因素有关,因此特异性的NA基因耐药检测是确定NA相关HBV耐药突变的必备条件。焦磷酸测序是一新兴的DNA测序技术,具有高准确性和敏感性,当变异株超过5%即可检出,并可定量检测多个耐药位点,能满足本研究检测HBV P基因区NA相关的常见耐药位点的需要；且检测快捷,已有用于LAM、ADV耐药检测的报道,与直接测序法的符合率高。目的：采用焦磷酸测序法分析HBV P基因区NA相关10个位点的突变情况,探讨NA治疗前的慢性HBV感染者耐药突变株的检出率和突变模式；NA治疗过程中出现的相关HBV耐药的突变位点、突变模式及相互关系；病毒学应答不完全的ADV治疗患者,HBV逆转录酶区耐药突变的发生；并对HBV耐药突变的患者进行个体化干预和随访观察。材料和方法：采用焦磷酸测序法对281例慢性HBV感染者的HBV P基因区10个位点（rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181V/T、rtT184G、rtA194T、rtS202I、rtM204V/I、rtN236T、rtM250V）进行定量检测。据患者HBV耐药突变的不同状态,进行个体化的干预治疗和随访观察。结果：①未经核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者HBV突变株的检出率为3.66%（3/82）,分别为2例单一rtA181T突变、1例单一rtV173L突变,突变株为非优势株。②NA治疗过程中,LAM相关耐药95例,检出4个突变位点呈11种模式,以rtM204突变多见；ADV相关耐药26例,检出2个突变位点呈6种模式,以rtA181V突变为主；LAM、ADV相关耐药者20例,检出5个突变位点呈6种模式,以rtA181T突变最常见；LdT相关耐药20例,检出4个突变位点呈5种模式,均存在rtM204I突变；ETV相关耐药10例,检出7个突变位点呈6种模式,以rtT184突变多见。③不同的LAM突变模式间、ADV突变模式间HBV DNA的水平差异无统计学意义（P>0.05）；LAM耐药组HBV DNA水平高于ADV耐药组（P<0.05）。④ADV治疗病毒学应答不完全的28例患者中,25例未检测到HBV突变株,3例未检出病毒。⑤对LAM、LdT、ETV耐药者加用ADV, ADV耐药（N236T）者加用LAM、包含rtA181T位点突变者加/换ETV治疗效果好,干扰素对部分耐药患者有效。⑥干预治疗后,25%（12/48）患者体内的耐药突变株比率在3月内下降,其中6.25%（3/48）突变株消失；治疗3月时,35.42%（17/48）例突变株及其比例同更换治疗前；16.67%（8/48）患者体内的耐药突变株会长期（≥6个月）存在；22.92%（11/48）患者体内会出现新的耐药突变位点。结论：①未经核苷（酸）类似物治疗的慢性HBV感染者体内很少存在自然突变株,且为非优势病毒株。②长期应用核苷（酸）类似物的慢乙肝患者可于HBV P基因区筛选出核苷（酸）类似物相关的耐药突变。LAM相关突变以rtM204为主,其中HM204V常伴有rtL180M突变,rtM204I可单独存在,rtV173L多出现在rtM204+rtL180M联合变异基础上；ADV相关突变以rtA181V多见；ETV相关突变以rtT184多见,均存在rtM204突变；LdT相关变异中均存在rtM204I突变。rtA181T与LAMADV应用有关。③LAM、ADV耐药突变模式间HBV DNA水平没有差异,LAM耐药组HBV DNA水平高于ADV耐药组。④阿德福韦酯治疗的慢性HBV感染者,基因型耐药不是病毒学应答不完全的原因。⑤对发生HBV耐药突变的患者要及时进行个体化治疗,据HBV耐药突变位点加／换用无交叉耐药的药物或干扰素,并定期检测病毒学应答情况。⑥经药物干预治疗后,HBV突变株在慢性HBV感染者体内可动态演变。

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