植物金属硫蛋白2型在烟草中的表达特性

论文摘要

为研究植物金属硫蛋白的功能及其特点以及在未来生产实践中的应用，本研究利用从印度芥菜（Brassica juncea）克隆分离到的金属硫蛋白2型（BjMT-2）cDNA基因，通过载体pBina用农杆菌介导法将BjMT-2基因转入模式植物烟草中进行了多项分子生物学方面的分析和观察。在烟草组织培养和基因转化过程中研究了不同激素组合、抗生素筛选浓度、侵染时间及农杆菌稀释浓度等影响烟草再生及转化诸因素的作用，建立了模式植物烟草的高效再生及转化体系。在分子生物学方面：运用PCR和Northern blot检测技术确定了目的基因BjMT-2被整合到烟草基因组中并具备表达功能。本研究通过基因工程学方法首次将金属硫蛋白基因连接为双聚体，克隆到原核表达载体pQE30中在大肠杆菌中进行诱导表达并通过氨基酸序列鉴定。在获得大量高纯度确定的双聚体金属硫蛋白的基础上制备了多克隆抗体，单一性识别BjMT-2。为植物金属硫蛋白2型在不同物种和组织间的精确鉴定和定位提供了有力的分子生物学工具。本研究确定：在正常条件下，转基因烟草叶片组织中谷胱甘肽和叶绿素含量与野生型没有明显差别，但经过100mM Cu22+胁迫后，两者的含量在转基因植株中均明显高于野生型；在转基因植物细胞膜系统中V-型ATP酶的活性低于野生型，而P-型ATP酶的活性则表现出明显的升高趋势；转入金属硫蛋白2型基因的烟草在植物形态和根部发育方面相对照于野生型都发生了显著的过渡性状变化。上述研究和观察结果填补了在同一研究领域迄今为止尚处于空白或忽略的内容。为植物金属硫蛋白的更深一步的研究奠定了坚实可靠的前期基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景
• 1.1.1 金属硫蛋白定义
• 1.1.2 金属硫蛋白的结构
• 1.1.3 植物金属硫蛋白
• 1.1.4 植物金属硫蛋白的结构
• 1.1.5 植物金属硫蛋白主要功能
• 1.1.6 植物对重金属的解毒
• 1.2 植物基因工程的研究方法
• 1.2.1 植物转基因技术
• 1.2.2 转化植株的筛选及检测方法
• 1.3 本文涉及的内容
• 1.3.1 目的基因BjMT-2
• 1.3.2 模式植物烟草
• 1.4 研究的目的与意义
• 2 金属硫蛋白（MT）基因转化烟草的研究
• 2.1 植物表达载体的构建
• 2.1.1 BjMT-2基因的克隆
• 2.1.2 质粒pBinar的消化与回收
• 2.1.3 BjMT-2基因与pBinar载体连接
• 2.1.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.5 电转化大肠杆菌
• 2.1.6 产物的PCR鉴定
• 2.1.7 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.8 表达载体转化根癌农杆菌
• 2.1.9 表达载体PCR鉴定
• 2.2 农杆菌介导的遗传转化
• 2.2.1 材料和试剂
• 2.2.2 转化步骤
• 2.2.3 转基因植株的获得
• 2.3 转基因植株的鉴定
• 2.3.1 转基因植物的筛选培养
• 2.3.2 烟草叶片总 DNA的提取及纯化
• 2.3.3 转基因植物的 PCR检测
• 2.3.4 烟草叶片的总 RNA的提取
• 2.3.5 转基因植物的 Northern blot检测
• 2.4 本章小结
• 3 金属硫蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂
• 3.2 大肠杆菌表达载体的构建
• 3.2.1 BjMT-2基因的克隆及pQE-BjMT-2的构建
• 3.2.2 pQE-2BjMT-2的构建
• 3.2.3 表达及纯化金属硫蛋白双聚体蛋白
• 3.3 转基因植物的Western blot检测
• 3.3.1 植物可溶性总蛋白提取
• 3.3.2 SDS-PAGE电泳分离蛋白质
• 3.3.3 Western blot
• 3.4 本章小结
• 4 转金属硫蛋白植株的分析测定
• 4.1 谷胱甘肽含量的测定
• 4.1.1 谷胱甘肽标准曲线的制定方法
• 4.1.2 烟草叶片古胱甘肽（GSH）的检测方法
• 4.1.3 谷胱甘肽含量
• 4.2 叶绿素含量测定
• 4.2.1 DMSO方法测定含量
• 4.2.2 叶绿素含量
• 4.3 转基因烟草ATPase活性的测定
• 4.3.1 材料及试剂
• 4.3.2 ATPase活性的测定
• 4.4 转基因植物的形态特征
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢