大豆酯酶的固定化及应用研究

论文摘要

由于农药残留而引起的人畜急、慢性中毒的事件屡见不鲜,食品安全问题引起了高度重视,传统的农药残留检测方法是气相色谱法和高效液相色谱法,但是此种方法仪器昂贵,操作复杂,不适合快速检测。近年来利用乙酰胆碱酯酶开展了很多农药快速检测的研究,但乙酰胆碱酯酶的提取产量低,成本高,不能满足当前农药残留检测的需求,而植物酯酶的成本大大低于乙酰胆碱酯酶,保质期也比较长,因此本文以大豆为材料,研究植物酯酶对农药的灵敏性,并且研制了快速检测酶片,主要结果如下:1.大豆酯酶的最佳提取方案为:将大豆样品按1:5料液比加入到0.3mol/L,pH 7.0的磷酸缓冲液中,磁力搅拌120min后,于5000rpm下离心,上清液即为大豆酯酶粗酶液。2.研究了大豆酯酶的最适反应条件:大豆酯酶酶液0.1 mL,底物a—乙酸萘酯0.1mL,pH值为7.5的缓冲液1.9 mL,浓度为0.25mg/mL的显色剂0.9 mL,反应总体积稀释至10 mL反应时间为5min,反应温度为30℃。3.对26种不同品种大豆进行筛选,确定总酯酶活性最高的通农10作为农药快速检测的品种,考察了大豆酯酶对8种农药的灵敏度,灵敏度为敌敌畏＞敌百虫＞对硫磷＞甲胺磷＞乐果＞氧乐果＞毒死蜱＞西维因。4.在三种滤纸(定性滤纸、定量滤纸、厚型层析滤纸)材料中筛选出厚型层析滤纸作为固定化酶材料,确定了固定化参数:酶液浓度为80%,pH值为7.5,固定化温度为4℃,固定化时间24h,鼓风干燥的最佳时间2h,鼓风干燥的最佳温度为40℃。5.硝酸纤维素膜固定化的最佳参数:硝酸纤维素膜预活化条件为:4℃下在0.1mol/LpH7.0的磷酸盐缓冲溶液中浸泡48h。固定化酶液浓度为70%,pH值为7.5,固定化温度为4℃,固定化时间48h,戊二醛浓度为0.25%,不添加牛血清白蛋白。6.壳聚糖膜固定化的最佳参数:酶液浓度为80%,pH值为7.5,固定化温度为4℃,固定化时间24h,戊二醛浓度为0.5%。7.研究了三种固定化酶的部分酶学性质,并与游离酶特性进比较,结果表明固定于壳聚糖膜后,最适温度为30℃,最适pH值为7.0,有良好的重复使用性能;固定于厚型层析滤纸后,最适最适温度为30℃,最适pH值为7.5,保存期限比游离酶大大提高,4℃保存一个月相对活力为90.4%;固定于硝酸纤维素膜后,最适温度为40℃,最适pH值为8.0。8.通过酶活回收率和酶片实用性比较,确定厚型层析滤纸为大豆酯酶固定化的最佳载体,并用此酶片对8种农药进行检测,检测限分别为敌敌畏0.01mg/L,敌百虫为0.1 mg/L,对硫磷为0.5 mg/L,甲胺磷为0.5 mg/L,乐果为1 mg/L,氧乐果为10 mg/L,毒死蜱10mg/L,西维因50 mg/L。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
• 1.我国利用农药现状
• 1.1 农药的残留现状
• 1.2 农药的种类、性质
• 1.3 农药污染对人体的的危害
• 1.4 农产品出口壁垒
• 2.农药残留的分析检测方法
• 2.1 农药残留常规色谱仪器分析法
• 2.2 农药残留快速检测法
• 3.酶固定化技术研究
• 3.1 酶的固定化方法
• 3.2 固定化酯酶酶源的筛选
• 3.3 大豆酯酶抑制法的优点
• 第二部分 实验研究
• 实验一 大豆酯酶的提取与性质研究
• 1.引言
• 2.材料
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 主要仪器
• 3.方法
• 3.1 试剂的配制
• 3.2 萘酚标准曲线的绘制
• 3.3 大豆酯酶活力测定
• 3.4 不同溶剂对大豆酯酶的提取效果研究
• 3.5 大豆酯酶反应条件优化
• 3.6 检测用大豆酯酶的筛选
• 3.7 大豆酯酶理化性质研究
• 3.8 大豆酯酶对农药灵敏度研究
• 4.结果
• 4.1 萘酚标准曲线的绘制
• 4.2 不同溶剂对大豆酯酶的提取效果研究
• 4.3 大豆酯酶反应条件优化
• 4.4 检测用大豆酯酶的筛选
• 4.5 大豆酯酶理化性质研究
• 4.6 大豆酯酶对农药最低检测限研究
• 5.讨论
• 5.1 大豆酯酶活力测定的影响因素
• 5.2 酶源的选择
• 实验二 大豆酯酶固定化研究
• 1.引言
• 2.材料
• 3.方法
• 3.1 固定化酶的活力测定
• 3.2 固定化酶酶活回收率的计算
• 3.3 固定化酶酶抑制检测方法
• 3.4 大豆酯酶固定化方法研究
• 3.5 固定化酶性质的研究
• 3.6 不同载体固定化大豆酯酶的效果比较
• 4.结果
• 4.1 大豆酯酶固定化方法研究结果
• 4.2 固定化酶性质的研究
• 4.3 不同载体固定化大豆酯酶的效果比较
• 5.讨论
• 5.1 固定化酶的影响因素
• 5.2 大豆酯酶固定化方法
• 5.3 固定化酶部分酶学性质
• 5.4 酶片的检测能力
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历