葡萄细胞的悬浮培养及诱导子对悬浮细胞多酚产量影响的研究

论文摘要

利用悬浮培养提高植物次生代谢物的产量,是生产某些次生代谢物的新方法。本实验利用鲜食葡萄巨峰,酿酒葡萄赤霞珠、黑比诺作为材料,以B5培养基作为基本培养基通过调整培养基的配比和激素浓度建立起了稳定的细胞悬浮体系,优化了细胞悬浮培养条件。通过在细胞悬浮培养过程中的不同时期添加不同浓度的外源诱导物质,蔗糖、苯丙氨酸。茉莉酸甲酯和紫外光（UV-C）处理,研究了诱导子对巨峰葡萄悬浮细胞生长和总酚、花青素、白藜芦醇产量的影响。为利用细胞培养进行次生代谢物的大规模工业化生产提供了理论依据。本实验研究结果如下:1.建立了稳定的葡萄细胞悬浮体系选择了适合葡萄愈伤组织产生和进行悬浮培养的激素浓度及配比、pH、蔗糖浓度等。不同的葡萄品种诱导愈伤组织和悬浮培养所需要的激素浓度与组合是不同的。以B5+250㎎·L-1水解酪蛋白+0.1㎎·L-1NAA+0.2㎎·L-1KT+30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂为诱导愈伤组织的培养基,三种材料均能建立起适合愈伤组织生长的培养体系。以B5+1㎎·L-1NAA+0.5㎎·L-16-BA+30g·L-1蔗糖组成的液体培养基能建立起适合巨峰生长的细胞悬浮体系。以B5+250㎎·L-1水解酪蛋白+2㎎·L-12,4-D+0.2㎎·L-1 KT+1% PVP+30g·L-1蔗糖组成的培养基能建立起适合赤霞珠生长的悬浮细胞系。以B5+1㎎·L-1NAA+0.5㎎·L-1 6-BA+0.2% PVP+30g·L-1蔗糖组成的培养基能建立起适合黑比诺生长的悬浮细胞系。从生长状况来看,三种材料的愈伤组织和悬浮细胞生活力均为巨峰>赤霞珠>黑比诺。巨蜂葡萄的悬浮细胞呈粘稠、均一、稳定的黄白色,以单个细胞和小细胞团的形式存在,适合进行诱导处理;酿酒葡萄赤霞珠和黑比诺的悬浮细胞主要以单个细胞和小细胞团的形式存在,底部存在有少量的的组织团块,颜色较深,易褐化。2.选择了适合悬浮培养的继代方法选取连续继代数次（3次以上）的新鲜、松软易碎的黄白色愈伤组织15-20g,放入装有40ml液体培养基的100ml三角瓶中,25℃下120rpm,黑暗条件下摇床上振荡培养,24h后将葡萄细胞悬浮液静置,将上层培养基连同单细胞和小细胞团一起转移到灭过菌的空三角瓶中继续振荡培养,弃去大的组织团块及大的细胞团。3-4d后视情况用同样的方法再转移一次。一周后将已经粘稠的、正处于对数生长期的细胞加入其体积一半的液体培养基稀释,继续振荡培养。达到一定体积后转移到大的三角瓶中,用同样的方法继续添加培养基振荡培养。直到达到一定数量的均一稳定的细胞悬浮培养液。在以后的继代过程接种量每40mL只要5～10g之间就可以快速建立起生长稳定的细胞悬浮培养体系.3.探索了防止和减轻悬浮细胞褐化的方法通过对愈伤组织的挑选、接种量的控制、转瓶、PVP和大孔吸附树脂的利用以及挽救等措施,探索了防止和减轻悬浮细胞褐化的方法。4.诱导处理对细胞生长的影响各种诱导处理对悬浮细胞生物量的增加都没有促进作用,相反诱导处理之后悬浮细胞会出现或轻或重的褐化现象。5.蔗糖对巨峰悬浮细胞多酚合成的影响不同浓度的蔗糖对悬浮细胞总酚的含量都有提高作用,并且总酚含量随着蔗糖浓度的增加而增加,但是蔗糖浓度越高褐化越严重。而蔗糖的添加对花青素的含量影响不大,30g·L-1的蔗糖能轻微提高花青素含量,7.5 g·L-1和15g·L-1的蔗糖对花青素的含量则有轻微抑制作用。对于白藜芦醇,适当浓度的蔗糖对其含量有提高作用,浓度过高则有抑制作用。15g·L-1的蔗糖能显著提高白藜芦醇的含量。6.苯丙氨酸对巨峰悬浮细胞多酚合成的影响苯丙氨酸的添加能显著提高总酚、花青素和白藜芦醇的含量。7.茉莉酸甲酯的添加对总酚和白藜芦醇的含量都有促进作用,但对花青素的含量有轻微的抑制作用。8.紫外光处理对巨峰悬浮细胞多酚合成的影响一定强度的紫外光UV-C处理能提高悬浮细胞的多酚含量。在紫外灯（直径D=2.5cm,长度L=88 cm,功率P=30W,λ=254nm）放在距悬浮细胞35cm处照射强度为41.5μW·cm-2条件下照射2h,总酚、花青素、白藜芦醇含量均有显著提高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物细胞培养技术概述
• 1.1.1 细胞培养技术的应用
• 1.1.2 培养基和激素的种类及作用
• 1.2 葡萄的研究和应用价值
• 1.2.1 葡多酚的作用及应用
• 1.2.2 白藜芦醇的作用
• 1.2.3 花青素的作用
• 1.3 植物悬浮培养概述
• 1.3.1 悬浮培养的影响因子
• 1.3.2 葡萄悬浮培养概述
• 1.3.3 悬浮细胞的生长测定方法概述
• 1.4 多酚合成的影响因素概述
• 1.4.1 光照对植物多酚合成的影响
• 1.4.2 碳源对植物多酚合成的影响
• 1.4.3 苯丙氨酸等各种诱导子对多酚合成的影响
• 1.4.4 影响多酚合成的其它因素
• 1.5 细胞培养过程中常见问题
• 1.5.1 细胞培养过程中的常见问题
• 1.5.2 大规模培养过程中存在的困难
• 1.6 多酚的提取测定方法综述
• 1.6.1 总酚提取测定方法
• 1.6.2 白藜芦醇提取测定方法
• 1.6.3 花青素类物质的提取测定方法
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 研究内容与技术路线
• 2.2.1 研究内容
• 2.2.2 技术路线
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 基本培养基类型的选择
• 2.3.2 愈伤组织的诱导和固体培养基的选择
• 2.3.3 悬浮培养基的选择和细胞悬浮系的建立方法
• 2.3.4 添加诱导子
• 2.3.5 选择多酚提取测定方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 愈伤组织的诱导和固体培养基的选择
• 3.1.1 不同材料、不同部位的愈伤组织诱导情况
• 3.1.2 愈伤组织的挑选
• 3.1.3 固体培养基对愈伤组织的诱导情况
• 3.1.4 不同pH 和蔗糖浓度下愈伤组织的生长状况
• 3.2 悬浮培养基的选择
• 3.2.1 悬浮培养基激素的选择
• 3.2.2 蔗糖浓度和pH 的选择
• 3.2.3 悬浮培养基组合的选择
• 3.3 不同接种量对悬浮细胞生长的影响
• 3.3.1 不同起始接种量对悬浮细胞生长的影响
• 3.3.2 不同继代接种量对悬浮细胞生长的影响
• 3.3.3 不同材料的愈伤组织和悬浮细胞培养状况比较
• 3.4 多酚提取测定方法的确定
• 3.4.1 总酚的不同提取方法结果分析
• 3.4.2 白藜芦醇的色谱条件
• 3.4.3 花青素的含量表示方法
• 3.5 未诱导处理的葡萄悬浮细胞总酚含量情况
• 3.5.1 继代次数对三种材料总酚含量的影响
• 3.5.2 未褐化与褐化细胞总酚含量的比较
• 3.5.3 三种材料总酚含量的比较
• 3.6 诱导子处理对悬浮细胞生长与多酚含量的影响
• 3.6.1 蔗糖的添加对悬浮细胞生长与多酚含量的影响
• 3.6.2 苯丙氨酸的添加对悬浮细胞生长和多酚含量的影响
• 3.6.3 茉莉酸甲酯的添加对悬浮细胞生长和多酚含量的影响
• 3.6.4 紫外光（UV-C）处理对多酚含量的影响
• 3.6.5 各种诱导子处理对悬浮细胞多酚含量的影响比较
• 第四章 讨论
• 4.1 葡萄悬浮细胞培养条件的选择及优化
• 4.1.1 材料的选取及愈伤组织的诱导
• 4.1.2 培养基的选择
• 4.1.3 pH 和接种量对细胞生长的影响
• 4.1.4 褐化的防止
• 4.2 诱导子对悬浮细胞生长的影响
• 4.2.1 蔗糖对多酚代谢的影响
• 4.2.2 苯丙氨酸对多酚代谢的影响
• 4.2.3 茉莉酸甲酯对多酚代谢的影响
• 4.2.4 紫外光处理对多酚代谢的影响
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介