Wntβ/-catenin信号通路与骨关节炎发病机制的实验研究

论文摘要

骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种中老年人常见的退行性骨关节疾病,以关节软骨破坏和骨赘形成为主要特征。在我国6城市进行的流行病学调查结果显示,40岁及以上人群中X线膝OA总患病率为28.7%,其中男性为23.5%、女性为32.8%。OA是一种多因素疾病,其发病与年龄、性别、遗传、肥胖、创伤、负重过度等因素均有关。传统观点认为OA的发病与IL-1、IL-6、TNF-α等促炎症因子及MMP-13.MMP-9等蛋白酶类产生过多有关,然而相关基因敲除小鼠的动物实验并没有为此提供有力的证据,在临床上应用抗炎药物及蛋白酶抑制剂治疗OA也没有取得很好的疗效。OA的分子发病机制还需要进一步阐明,近年来的研究表明Wnt/β-catenin信号通路在OA的发病过程中起着重要作用。动物实验表明特异性增加小鼠关节软骨细胞中β-catenin的表达,小鼠成年后膝关节可以出现OA样的改变,提示上调的Wnt/β-catenin信号通路与动物OA的发生有关。那么OA患者的关节软骨组织中Wnt/β-catenin信号通路是否也上调?为此我们研究了行人工膝关节置换术OA患者的关节软骨组织中β-catenin和MMP-13蛋白的表达情况,以及Wntβ-catenin信号通路下游软骨细胞分化的标志性基因BMP-2、COL-X和MMP-13的表达水平,以进一步探讨Wnt/β-catenin信号通路在OA发病机制中的作用。目的1 OA患者及正常对照组关节软骨细胞中β-catenin和MMP-13蛋白表达水平的研究。2 OA患者不同病变组及正常对照组关节软骨组织中BMP-2、COL-X和MMP-13基因表达水平的研究。方法研究组：取自行人工膝关节置换术OA患者的关节软骨组织,共42例；对照组：天津医科大学解剖学教研室无偿提供的膝关节软骨标本,共8例。关节软骨组织经固定、包埋、切片后,分别行HE、番红O/固绿和阿辛蓝／橙黄G三种病理染色。根据改良的Mankin关节软骨病理评分标准分为对照组、轻度病变组和中度病变组。应用免疫组织化学的方法检测关节软骨细胞中β-catenin和MMP-13蛋白的表达情况,采用X2检验或确切概率法进行统计学分析。提取42例行人工膝关节置换术OA患者和10例对照组的关节软骨组织总RNA,并逆转录为cDNA,应用Real Time RT-PCR的方法,选用β2M为内参,检测软骨组织中BMP-2、COL-X和MMP-13基因的表达情况,并比较各组间上述基因的表达差异,采用SPSS17.0统计软件进行独立样本t检验。结果1. OA患者关节软骨组织出现不同程度的病理改变：如软骨表面不同程度破坏;软骨细胞肥大增生,排列紊乱,细胞成簇,以至减少消失；潮线断裂,有新生血管通过并连通骨髓腔等。2.β-catenin免疫组化染色结果：对照组全部为阴性；OA患者研究组轻度病变组9例阳性、阳性率60.0%,中度病变组7例阳性、阳性率25.9%。MMP-13免疫组化染色结果：对照组1例阳性,阳性率12.5%；OA患者研究组轻度病变组14例阳性、阳性率93.3%,中度病变组21例阳性、阳性率77.8%。3. Real Time RT-PCR结果显示轻度病变组BMP-2.COL-X和MMP-13基因的表达水平分别为对照组的6.64、8.12和9.92倍,差异均有统计学意义（均P<0.01）；中度病变组BMP-2、COL-X和MMP-13基因的表达水平分别为对照组的2.21、2.81和2.46倍,差异均有统计学意义（均P<0.05）结论1.OA患者的关节软骨细胞中β-catenin和MMP-13蛋白的表达水平明显增加。2.OA患者关节软骨组织中细胞分化的标志性基因BMP-2、COL-X和MMP-13的表达水平显著增加。3.上调的Wnt/β-catenin信号通路可能与人类OA的发生密切相关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 1 对象和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 溶液及药品配置
• 1.2 研究对象
• 1.3 病理学染色方法
• 1.3.1 标本的处理
• 1.3.2 HE染色
• 1.3.3 番红O/固绿染色
• 1.3.4 阿辛蓝/橙黄G染色
• 1.3.5 改良的Mankin关节软骨病理评分标准
• 1.4 免疫组织化学染色方法
• 1.4.1 β-catenin免疫组化染色
• 1.4.2 MMP-13免疫组化染色
• 1.5 Real Time RT-PCR方法
• 1.5.1 标本取材
• 1.5.2 实验用品准备
• 1.5.3 关节软骨组织中总RNA提取
• 1.5.4 总RNA浓度、纯度测定
• 1.5.5 逆转录合成cDNA第一链
• 1.5.6 引物设计
• 1.5.7 BMP-2、COL-Ⅹ和MMP-13基因cDNA的PCR检测
• 1.5.8 PCR产物检测
• 1.5.9 Real Time PCR相对定量原理及方法
• 1.6 统计学方法
• 2. 实验结果
• 2.1 镜下形态学观察和病理评分结果
• 2.2 免疫组织化学染色结果
• 2.2.1 β-catenin免疫组化结果
• 2.2.2 MMP-13免疫组化结果
• 2.3 Real Time RT-PCR结果
• 2.3.1 总RNA纯度鉴定
• 2.3.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物及DNA序列分析
• 2.3.3 定量PCR产物的融解曲线
• 2.3.4 BMP-2、COL-Ⅹ和MMP-13基因表达的统计分析
• 3. 讨论
• 3.1 骨关节炎的发生及病理改变
• 3.2 Wnt/β-catenin信号通路
• 3.3 Wnt/β-catenin信号通路与骨关节炎
• 3.4 BMP-2、COL-Ⅹ、MMP-13与骨关节炎
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢