论文摘要
研究背景和目的鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma,NPC）是一种主要发生在我国南方地区的鼻咽部的恶性上皮性肿瘤。由于NPC发生的部位比较隐蔽,早期症状常不明显而容易被忽略,因此确诊的患者有60%以上都是中、晚期,常伴有转移。对这类患者除了采用常规的放疗外,化疗也是必不可少的一种治疗方法。但是由于耐药性的产生,往往容易导致患者复发,因此对化疗药物耐药性的研究具有重要的临床意义。研究表明,在NPC化疗中,含铂类方案的治疗效果要优于非铂类方案,而在铂类方案中最常用的是顺铂。目前认为肿瘤细胞对顺铂产生耐药性的机制非常复杂,比较引人关注的就是耐药细胞如何能够阻断顺铂与DNA的结合,而其中能把毒性药物泵出细胞外而使药物蓄积减少的ABC（ATP binding cassette,ABC）转运蛋白家族就成为了研究的热点。ABC转运蛋白的作用机制主要是通过其跨膜区域与底物结合,通过水解ATP产生能量而把底物泵出细胞外。目前发现的ABC转运蛋白家族共有48个基因,根据跨膜区域的不同可分为A、B、C、D、E、F、G七个亚族,其中常见的与耐药相关的基因有十个:ABCA2、ABCB1（也称为MDR1、P-gp）、ABCC1（也称为MRP1）、ABCC2（也称为MRP2、cMOAT）、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCC6、ABCC11、ABCG2。有报道发现ABCC2不但可在细胞膜表达,也可在细胞核膜表达;有研究表明当ABCC2表达降低的时候细胞对顺铂的敏感性增加,而ABCC2表达增加的时候细胞对顺铂的耐药性增加。目前在NPC中尚未见ABCC2与顺铂之间关系的探讨,因此本课题拟以NPC为研究对象,探讨ABCC2与顺铂耐药的关系,为NPC的临床化疗提供参考。方法1.从临床收集具备临床预后资料的病例,根据对顺铂化疗的情况分为敏感组和不敏感组,通过免疫组化SP法检测ABCC2的表达水平,然后对结果进行半定量积分法分析。统计分析ABCC2的表达与性别、年龄、肿瘤分期、化疗效果及预后的关系。同时根据化疗的方案分为PF（DDP+5-Fu）、PFB（DDP+5-Fu+平阳霉素）、PFD（DDP+5-Fu+艾素）及PV（DDP+长春新碱）组,并与ABCC2的表达情况进行统计分析。2.对CNE2细胞用顺铂单独诱导以及用顺铂+5-氟脲嘧啶联合进行诱导,经诱导一年左右,用MTT法检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的变化;MTT法检测多药耐药逆转剂PSC833作用前后顺铂对耐药细胞及敏感细胞的抑制率,并计算出IC50以及耐药指数;荧光定量PCR法检测十种常见的与耐药相关的ABC转运蛋白在诱导前后mRNA的变化,免疫细胞化学法检测ABCC2蛋白质的表达情况;高效液相色谱法检测PSC833作用前后耐药细胞内顺铂蓄积的变化情况。3.利用已构建的ABCC2慢病毒干扰载体,对CNE2细胞进行RNA干扰,筛选出稳定的干扰株,用荧光定量PCR法检测ABCC2在干扰前后mRNA的变化;Western Blot法和免疫细胞化学法检测干扰前后ABCC2蛋白表达的情况;用MTT法检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞周期的变化;MTT法检测干扰前后顺铂对细胞的抑制情况并计算出IC50;高效液相色谱法检测干扰前后细胞内顺铂蓄积的变化情况。最后通过裸鼠皮下移植瘤实验来探讨干扰克隆在体内对DDP的敏感性。结果1、鼻咽癌组织中ABCC2表达及临床意义（1）共收集84例NPC标本。SP免疫组化结果表明,ABCC2表达主要定位在细胞膜和细胞浆,少数可见表达于细胞核。经统计分析,ABCC2的表达与患者的年龄、性别、临床分期的相关性均无统计学差异（P＞0.05）。（2） 84例标本中化疗敏感组为50例,其中ABCC2高表达的占34%（17/50）;不敏感组为34例,其中ABCC2高表达的占65%（22/34）,两组ABCC2的表达有显著性差异（Z=3.71,P＜0.01）,不敏感组中ABCC2的表达要高于敏感组,提示ABCC2的表达与化疗效果有关。进一步对化疗方案与ABCC2的表达情况进行分析,结果表明ABCC2的表达与PFB、PFD、NP等联合化疗方案的疗效的相关性无统计学差异,而与PF方案的疗效有关（Z=1.481,P＜0.05）（3） 84例标本中有转移的为74例,其中ABCC2高表达的有36例（50%）;未转移的10例,其中ABCC2高表达的有3例（30%）,两组ABCC2的表达有显著性差异（Z=2.05,P＜0.01）,转移组中ABCC2的表达要高于未转移组,提示ABCC2的表达与转移有关。进一步对转移组和未转移组中化疗效果与ABCC2表达的关系进行探讨,结果发现在转移组中,化疗不敏感组中ABCC2的表达显著高于化疗敏感组（Z=3.52,P＜0.01）。2、耐药细胞株的鉴定及ABCC2表达的检测（1）用DDP诱导CNE2 12个月（CNE2/DDP）、DDP+5Fu联合诱导CNE2 12个月（CNE2/DDP+5Fu）后,MTT法检测PSC833作用前后DDP对三种细胞的抑制情况,计算出IC50,结果表明与CNE2相比,CNE2/DDP、CNE2/DDP+5Fu对顺铂更加耐药,并能被PSC833部分逆转。通过比较IC50,CNE2/DDP对顺铂的耐药性增加了2.63倍,逆转后降为1.63倍;而联合诱导耐药的CNE2/DDP+5Fu对顺铂的耐药性增加了5.35倍,逆转后降为4.62倍。（2） MTT法检测三种细胞的增殖能力,绘制生长曲线,结果表明三种细胞增殖能力没有统计学差异（F=0.192,P＞0.05）;流式细胞术结果也表明三种细胞的细胞周期变化也不具有统计学差异（F=0.142,P＞0.05）。（3）荧光定量RT-PCR法检测三组细胞中十种常见的与耐药有关的ABC转运蛋白的表达情况,结果表明在两株耐药细胞中只有ABCC2的表达均上调,具有统计学差异（F=37.24,P＜0.05）。CNE2/DDP中ABCC2的表达增高了1.73倍,CNE2/DDP+5Fu中ABCC2的表达增高了3.96倍。（4）细胞免疫化学法检测三组细胞中ABCC2蛋白表达的情况,结果表明CNE2/DDP、CNE2/DDP+5Fu细胞中ABCC2蛋白的表达明显上调,并且在更耐药的CNE2/DDP+5Fu细胞中发现ABCC2还可在细胞核中表达。（5）高效液相色谱法检测PSC833逆转前后细胞内顺铂蓄积变化的情况,结果表明逆转前DDP在耐药细胞中的蓄积减少,顺铂在细胞内的蓄积分别减少了2.07倍（CNE2/DDP）和2.82倍（CNE2/DDP+5Fu）;逆转后顺铂在细胞的蓄积有所增加,DDP在细胞内的蓄积在CNE2/DDP细胞中降为1.35倍,在CNE2/DDP+5Fu细胞中降为1.36倍。3、ABCC2表达下调对CNE2细胞生物学特性的影响（1）利用已构建好的慢病毒干扰载体,包装慢病毒后,用含有干扰载体的慢病毒感染CNE2细胞,杀稻瘟菌素筛选抗性克隆,约14天后,挑取抗性单克隆并扩大培养,筛选3个月后,利用荧光定量PCR技术检测各克隆的ABCC2表达情况,筛选出干扰效率较高的两个克隆（66.1%、66.8%）为下一步实验的研究对象。Western Blot法表明两株干扰克隆ABCC2蛋白下调分别为71.9%和69.1%;免疫细胞化学法结果表明ABCC2在CNE2和阴性对照中的表达强度较一致,而两个干扰克隆中ABCC2的表达明显下调。两株干扰克隆分别命名为CNE2/pshRNA-ABCC2-1、CNE2/pshRNA-ABCC2-2,阴性对照为CNE2/pshRNA。（2） MTT法检测细胞增殖情况,与阴性对照和CNE2细胞相比,两个干扰克隆中细胞的增殖速度没有统计学差异（F=0.063,P＞0.05）;流式细胞术结果也表明各组细胞中细胞周期的变化不具有统计学差异（F=0.181,P＞0.5）。（3） MTT法检测细胞干扰前后对顺铂敏感性的变化,结果表明干扰后细胞对顺铂的敏感性增加,两株干扰克隆与CNE2相比均具有统计学差异（F=4.08,P＜0.05）,分别增加了3.96倍和3.42倍。（4）高效液相色谱法检测干扰前后细胞内顺铂蓄积的变化,结果表明ABCC2表达下调后,顺铂在两株干扰克隆细胞内的蓄积增加,与CNE2相比均具有统计学差异（F=97.23,P＜0.01）,分别增加了2.66倍和3.11倍。（5）以DDP敏感性最高的CNE2/pshRNA-ABCC2-1作裸鼠皮下移植瘤实验,免疫组化结果表明,在裸鼠体内CNE2/pshRNA-ABCC2-1克隆中ABCC2仍维持于低表达水平;然后计算出平均相对肿瘤体积及相对肿瘤增殖率,结果表明经DDP作用后,CNE2/shABCC2-1相对肿瘤体积减少,生长减慢,与CNE2、阴性对照组相比均有统计学差异（P均小于0.05）。结论1、ABCC2的表达与鼻咽癌组织对含顺铂化疗的疗效特别是PF（即DDP+5-氟脲嘧啶）方案有关,并且与转移有关,提示可考虑将ABCC2的表达情况作为预示NPC患者的化疗效果和预后的指标之一;2、成功构建出两株耐药细胞株,分别对DDP耐药（CNE2/DDP）及对DDP、5-氟脲嘧啶耐药（CNE2/DDP+5Fu）。耐药细胞株中ABCC2表达增加,同时耐药细胞内DDP蓄积减少,其细胞对DDP的耐药性更高。3、成功筛选出两株ABCC2表达减少的干扰克隆,其细胞内顺铂蓄积增加,对顺铂也更加敏感。裸鼠皮下移植瘤实验也证明在DDP作用后干扰组的肿瘤生长明显受到抑制。4、本研究表明ABCC2的表达与NPC对DDP耐药之间的关系密切。本研究的创新之处1、通过免疫组化SP法证实ABCC2的表达与鼻咽癌组织对含DDP化疗特别是PF方案的疗效有关,并且与患者的转移有关,并提出为可将ABCC2的表达情况作为预示NPC患者的化疗效果和预后的指标之一,为临床鼻咽癌的化疗提供参考。2、诱导出两株耐药细胞株,并发现细胞对顺铂的耐药与ABCC2的表达有关,并能被逆转剂PSC833部分逆转,为研究鼻咽癌的化疗提供新的思路。3、利用慢病毒载体和RNAi技术建立了ABCC2表达稳定下调的CNE2细胞株,为进一步阐明在鼻咽癌中ABCC2与顺铂的关系提供有效的实验手段;4、初步证实ABCC2与鼻咽癌对顺铂的耐药有关。