论文题目: 枯草杆菌脂肪酶的基因克隆、定向进化与非水酶学研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 马吉胜
导师: 曹淑桂,冯雁
关键词: 枯草杆菌,脂肪酶,基因克隆,定向进化,非水酶学
文献来源: 吉林大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本文从原始的枯草杆菌质粒pBD64 出发,通过设计两段DNA片段,引入了多个酶切位点和一个强启动子序列,构建了一个枯草杆菌脂肪酶高表达质粒pBSR2;该质粒载体与一段成熟的脂肪酶基因相连接,在枯草杆菌宿主中实现了高效表达。通过对枯草杆菌脂肪酶BSL 的表达、分离和纯化,进一步研究了这种酶的分子量、酶活力、最适反应温度、最适反应pH、反应动力学等基本酶学性质。 通过采用易错PCR 和DNA 改组策略,对枯草杆菌脂肪酶进行了酶活力定向进化研究。经过两轮的易错PCR 和一轮的DNA改组,获得了一株酶活力提高4.5 倍的突变体。对突变菌株进行表达纯化后,对其酶学性质也进行了与野生型的对比研究。经基因测序和蛋白分析,进一步解释了对突变体酶活力和稳定性提高的可能机制。 在应用枯草杆菌脂肪酶催化拆分外消旋2-辛醇的研究中发现,底物的摩尔比、酶的用量、反应温度、水含量以及反应前酶冻干时所处缓冲液的pH、离子强度等因素都对反应的催化活性及立体选择性的有着较大的影响。
论文目录:
第一章 前言
第一节 脂肪酶
1. 脂肪酶简介
2. 脂肪酶的基因研究
3. 脂肪酶的催化机理
4. 脂肪酶的性质研究
5. 脂肪酶的应用研究
第二节 枯草杆菌
1. 枯草杆菌简介
2. 枯草杆菌基因表达系统
3. 外源蛋白在枯草杆菌中的表达机制
4. 影响枯草杆菌基因表达的因素与解决对策
第三节 非水酶学
1. 非水相酶催化的优点
2. 非水相酶催化反应的影响因素
第四节 定向进化
1. 定向进化的原理
2. 定向进化的策略
3. 定向进化的筛选策略
4. 定向进化的应用
第五节 本论文的立题依据和研究内容
参考文献
第二章 枯草杆菌脂肪酶的基因克隆、表达纯化与表征
第一节 引言
第二节 枯草杆菌脂肪酶重组质粒的构建
1、实验材料
2、实验方法
2.1 双链DNA的合成
2.2 质粒 DNA 的小量制备
2.3 从琼脂糖凝胶中回收DNA
2.4 从细菌中小量制备基因组DNA
2.5 引物设计
2.6 目的基因的PCR 扩增和纯化
2.7 PCR 产物的酶切和纯化
2.8 载体DNA 的限制性酶切、纯化和去磷酸化
2.9 目的基因与载体的连接
2.10 枯草杆菌感受态细胞的制备及转化
2.11 单克隆菌株的筛选与鉴定
2.12 目的基因的序列测定
3、结果与讨论
3.1 引入 DNA 片段的设计与获得
3.2 重组质粒的构建
3.2.1 质粒载体的提取、酶切、纯化及磷酸化处理
3.2.2 目的基因的克隆、限制性酶切及纯化
3.2.3 目的基因与引入的DNA 片段、质粒载体的连接
3.2.4 重组质粒的转化及鉴定
第三节 枯草杆菌脂肪酶的表达与纯化
1、实验材料
2、实验方法
2.1 生长表达曲线
2.2 脂肪酶粗酶的制备
2.3 脂肪酶的分离纯化
2.4 脂肪酶的活力测定
2.5 蛋白浓度的测定
2.6 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.7 蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
3、结果与讨论
3.1 枯草杆菌生长表达曲线
3.2 脂肪酶的分离纯化
3.3 纯化脂肪酶的 SDS-PAGE 电泳和活力染色
第四节 枯草杆菌脂肪酶的基本酶学性质
1、实验材料
2、实验方法
2.1 温度对酶活力的影响
2.2 pH 对酶活力的影响
2.3 脂肪酶的稳定性
2.4 酶反应动力学
2.5 底物特异性
2.6 金属离子和表面活性剂对酶活力的影响
2.7 胆酸钠盐对酶活力的影响
2.8 酶活力测定
3、结果与讨论
3.1 温度对酶活力的影响
3.2 pH 对酶活力的影响
3.3 底物特异性
3.4 酶反应动力学
3.5 金属离子和表面活性剂对酶活力的影响
3.6 胆酸钠盐对酶活力的影响
本章小结
参考文献
第三章 枯草杆菌脂肪酶的定向进化
第一节 引言
第二节 易错 PCR 和 DNA 重组对枯草杆菌脂肪酶的定向进化.
1、实验材料
2、实验方法
2.1 质粒 DNA 的小量制备
2.2 从琼脂糖凝胶中回收 DNA
2.3 从细菌中小量制备基因组 DNA
2.4 引物设计
2.5 易错 PCR
2.6 DNA 改组
2.7 易错PCR 和 DNA 重组产物的酶切和纯化
2.8 载体 DNA 的限制性酶切、纯化和去磷酸化
2.9 突变库的构建
2.10 高活力菌株的筛选
2.11 突变体活力测定
2.12 脂肪酶的分离纯化
2.13 突变体的热稳定性
2.14 突变体的pH 稳定性
2.15 突变基因的序列测定
3、实验结果
3.1 易错 PCR 突变库的构建和筛选结果
3.2 DNA 重组突变库的构建和筛选结果
3.3 突变体的最适温度和稳定性
3.4 突变体的最适pH 值和稳定性
3.5 突变体的基因的序列测定及蛋白质结构预测
4、讨论
4.1 突变库的库容
4.2 筛选方法
4.3 定向进化方案
本章小结
参考文献
第四章 枯草杆菌脂肪酶的非水酶学
第一节 引言
第二节 枯草杆菌脂肪酶催化乙酸乙烯酯拆分(R,S)-2-辛醇
1、实验材料
2、实验方法
2.1 酶催化的(R,S)-2-辛醇酯交换反应
2.2 溶剂及脂肪酶含水量的测定
2.3 有机溶剂干燥除水
2.4 制备一定pH 和离子强度的冻干酶粉
2.5 底物转化率的测定
2.6 2-辛醇的光学纯度(ee)测定
2.7 酶立体选择性(Eantiomeric ratio,E 值)的测定
2.8 产物的分离
2.9 光学纯度检验
3、实验结果与讨论
3.1 底物摩尔比对催化拆分(R,S)-2-辛醇的影响
3.2 酶量对催化拆分(R,S)-2-辛醇的影响
3.3 温度对催化拆分(R,S)-2-辛醇的影响
3.4 反应进程的分析
3.5 酶分子微环境的影响
3.5.1 冻干酶粉pH的影响
3.5.2 冻干酶粉离子强度的影响
第三节 枯草杆菌脂肪酶催化双乙烯酮拆分(R,S)-2-辛醇
1、实验材料
2、实验方法
2.1 酶催化的(R,S)-2-辛醇酯交换反应
2.2 溶剂及脂肪酶含水量的测定
2.3 有机溶剂干燥除水
2.4 脂肪酶活力测定
2.5 底物转化率的测定
2.6 2-辛醇的光学纯度(ee)测定
2.7 酶立体选择性(Eantiomeric ratio,E 值)的测定
2.8 产物的分离
2.9 光学纯度检验
2.10 温度对拆分产率的影响
2.11 水含量对拆分的影响
3、实验结果与讨论
3.1 底物摩尔比的影响
3.2 酶浓度的影响
3.3 反应体系中溶剂的影响
3.4 反应温度的影响
3.5 水含量的影响
本章小结
参考文献
作者简历
致谢
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英文摘要
发布时间: 2005-08-26
参考文献
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- [5].冰川土壤低温脂肪酶基因多样性研究及其基因克隆[D]. 张宇宏.中国农业科学院2008
- [6].脂肪酶的固定化及其催化性能的研究[D]. 赵丽芳.吉林大学2008
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