鲫鱼PKR-like Zα结构域结合核酸的分析

论文摘要

鲫鱼PKR基因（CaPKR-like）是鱼类第一个、也是非哺乳类脊椎动物第一个报道的PKR同源物。该基因编码的蛋白N-端没有典型的dsRBM区域，取而代之的是两个Z-DNA结合区域（Zα1和Zα2）。所以，CaPKR-like是Zα蛋白家族成员。CaPKR-like可能同时具有哺乳动物类干扰素系统中两种重要效应蛋白ADAR1和PKR结构特征。故而对Zα结构的研究有助于丰富对鱼类细胞的抗病毒免疫反应过程和机制的认识。本文在前期工作基础上，将从SMART-cDNA文库中克隆得到的CaPKR-like Zα1、Zα2及Zα1Zα2结构域cDNA重组至载体中，原核表达三种融合多肽(PZα1、PZα2及PZα1Zα2)。亲和层析纯化表达产物，得到ZαPKR-like。凝胶阻滞实验分析表达ZαPKR-like与Poly I：C、鲑精DNA、重组质粒d（CG）13、d（CG）13的亲和性。结果表明，PZα1、PZα2及二者的混合物均不能与双链RNA（Poly I：C）和鲑精DNA及d（CG）13结合。而PZα1Zα2与Poly I：C和鲑精DNA及d（CG）13有明显的结合，而且随PZα1Zα2浓度的增加，Poly I：C、鲑精DNA、重组质粒d（CG）13和d（CG）13在琼脂糖凝胶电泳中的阻滞作用越明显。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 Zα蛋白家族
• 1.1 Z-DNA与Zα
• 1.1.1 ADAR
• 1.1.2 E3L
• 1.1.3 DLM-1
• 1.1.4 鱼类PKZ
• 1.2 Zα的生物学功能
• 1.2.1 RNA编辑与抗病毒
• 1.2.2 胚胎发育
• 1.3 Zα结合核酸的研究方法
• 1.3.1 PCR定点突变法
• 1.3.2 凝胶阻滞实验
• 1.3.3 原子力显微镜
• 1.3.4 圆二色谱
• 1.3.5 酵母单杂交体系
• 1.3.6 核磁共振
• 1.4 本研究的内容、目的及意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要仪器和设备
• 2.1.2 主要试剂、试剂盒
• 2.1.2.1 主要试剂
• 2.1.2.2 试剂盒
• 2.1.3 载体和菌株
• 2.1.4 实验材料
• 2.1.5 课题来源
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 CaPKR-like Zα克隆载体的构建
• 2.2.1.1 引物设计
• 2.2.1.2 目的基因的克隆
• 2.2.1.3 目的基因连接pMD18-T载体
• 2.2.1.4 连接产物的转化和鉴定
• 2.2.2 CaPKR-like Zα原核表达载体的构建
• 2.2.2.1 质粒的提取与酶切
• 2.2.2.2 酶切产物的回收
• 2.2.2.3 目的基因片段与表达载体pET-32a的连接
• 2.2.2.4 连接产物的转化与鉴定
• 2.2.3 原核表达
• 2.2.4 表达产物的纯化
• 2.2.5 凝胶阻滞分析
• 2.2.5.1 Pzα与Poly I:C的结合
• 2.2.5.2 Pzα与鲑精DNA的结合
• 2.2.5.3 不同浓度Pzα与鲑精DNA的结合
• 2.2.5.4 Pzα与重组质粒的结合
• 13的结合'>2.2.5.5 Pzα与d（GC）₁₃的结合
• 第3章 实验结果
• 3.1 CaPKR-like Zα阳性克隆的筛选
• 3.2 CaPKR-like Zα
• 3.2.1 质粒双酶切实验
• 3.2.2 与pET-32a的连接
• 3.3 原核表达与纯化
• 3.3.1 Zα表达分析
• 3.3.2 Zα表达产物的纯化
• 3.4 Pzα与核酸结合
• 3.4.1 Pzα与Poly I:C的结合
• 3.4.2 Pzα与鲑精DNA的结合
• 3.4.3 不同浓度Pzα与鲑精DNA的结合
• 3.4.4 Pzα与重组质粒的结合
• 13的结合'>3.4.5 Pzα与d（GC）₁₃的结合
• 第4章 分析与讨论
• 4.1 凝胶阻滞分析
• PKR-like与核酸分子亲和性分析'>4.2 Zα_PKR-like与核酸分子亲和性分析
• PKR-like与Poly I:C的结合'>4.2.1 Zα_PKR-like与Poly I:C的结合
• PKR-like与鲑精DNA的结合'>4.2.2 Zα_PKR-like与鲑精DNA的结合
• Zα与d（GC）₁₃的结合'>4.2.3 P_Zα与d（GC）₁₃的结合
• PKR-like功能的初探'>4.3 Zα_PKR-like功能的初探
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略语表
• 致谢