海参糖胺聚糖抑制血小板—内皮细胞粘附及其机制的研究

论文摘要

海参糖胺聚糖抑制血小板—内皮细胞粘附及其机制的研究目的血小板-内皮细胞粘附在血栓形成，尤其在动脉血栓形成中占有举足轻重的地位。玉足海参糖胺聚糖（GAG）具有良好的抗血栓作用，但GAG对血小板粘附功能的影响目前尚未见报道。本课题应用平板流动小室模型检测GAG对血小板-内皮细胞粘附的影响，并选择血小板表面粘附受体及内皮细胞合成和分泌的促栓因子作为研究靶点，以进一步探讨GAG抗血小板-内皮细胞粘附、抗血栓形成的可能机制。方法1人脐静脉内皮细胞（HUVECs）原代培养。根据细胞形态、特异性抗原合成和分泌、因子Ⅷ免疫荧光反应进行细胞鉴定。2 MTT比色试验检测GAG对细胞活力的影响。3凝血酶活化洗涤血小板与HUVECs，通过注射泵推动荧光素标记血小板悬液在平板流动小室模型内形成模拟体内血液流动的环境，利用内皮细胞体外培养技术形成模拟血管壁的内皮细胞单层，并检测不同切变率下、不同浓度GAG对活化血小板与HUVECs粘附反应的干预作用。通过荧光显微电视系统实时观察并记录血小板-内皮细胞粘附过程，通过激光共聚焦显微镜获取粘附反应图像，测定粘附率。4经阴茎背静脉注入凝血酶，建立小鼠急性血栓形成模型。观察提前注射GAG或肝素对小鼠死亡率的影响，并应用流式细胞仪检测GAG和肝素对急性血栓形成小鼠血小板GPⅡb／Ⅲa复合物表达的影响。体外使用凝血酶活化人血小板，应用流式细胞仪检测GAG及肝素对活化人血小板GPⅠb表达的干预作用。5不同浓度GAG或肝素与凝血酶活化的HUVECs共同孵育。收集细胞培养上清液，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测活化HUVECs合成和分泌至细胞培养上清液中的vWF抗原和PAI-1抗原含量。TritonX-100裂解HUVECs，ELISA法检测活化HUVECs细胞内vWF抗原含量。实时荧光定量PCR法（RQ-PCR）检测GAG和肝素对活化HUVECs vWF mRNA和PAI-1 mRNA转录活性的影响。结果1 HUVECs原代培养及鉴定采用酶消化法获取HUVECs，M199-20％精制胎牛血清-2raM谷氨酰胺培养液中培养7～10天细胞可生长至完全融合。根据倒置显微镜下典型的“铺路卵石样”细胞形态，可以合成和分泌vWF，因子Ⅷ抗原抗体荧光标记染色呈阳性反应的特点证实所培养的细胞为HUVECs。0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA液消化细胞并进行传代，第一代细胞用于实验。2 GAG对细胞活力的影响在1mg／L～5mg／L浓度范围内，与凝血酶组相比，GAG对HUVECs细胞活力无明显影响。但是随着GAG浓度的进一步升高，细胞活力下降。当GAG浓度超过10mg／L时，细胞活力显著下降（P＜0.001）。当GAG浓度达到40mg／L时，细胞培养终止后，在倒置显微镜下可见大片细胞脱失，提示GAG浓度过高会导致细胞损伤。3 GAG对血小板与内皮细胞粘附的影响在流动小室模型中，通过改变血小板悬液流速，使切变率分别为1100s-1和300s-1。在这两种切变率下，凝血酶活化后血小板与HUVECs的粘附反应较未活化血小板与HUVECs的粘附反应均明显增加。用不同浓度GAG（1 mg／L～10mg／L）干预后，可以不同程度的抑制高、低切变率下血小板与HUVECs的粘附反应。其中GAG5mg／L组抑制作用最为明显，高、低切变率下的粘附率分别是凝血酶组粘附率的35％和40％（P＜0.001，P＜0.01）。提示GAG对活化血小板与HUVECs的粘附反应，尤其是高切变率下的粘附反应具有明显的抑制效应。肝素对高、低切变率下血小板-内皮细胞粘附也呈抑制作用，但均弱于相同剂量的GAG。4 GAG对血小板粘附受体表达的影响GAG和肝素可以显著降低急性血栓形成小鼠死亡率。GAG组和肝素组小鼠凝血酶注射10分钟后，血小板GPⅡb／Ⅲa复合物的表达量较对照组明显降低（P＜0.001，P＜0.001），GAG组降低得略明显，但是与肝素组相比差异并无统计学意义（P=0.06）。40分钟后对照组和GAG组血小板GPⅡb／Ⅲa复合物的表达量较10分钟时水平轻度增加，而肝素组的表达量则呈轻度下降趋势，但GAG组和肝素组同对照组相比均具有显著性差异（P＜0.001，P＜0.001）。GAG或肝素与凝血酶共同作用于血小板，血小板GPⅠb表达量分别为对照组的3倍及4倍，肝素上调GPⅠb表达的作用更为明显，二者与对照组相比均具有显著性差异（P＜0.001，P＜0.001）。5 GAG对内皮细胞促栓因子表达的影响与对照组相比，凝血酶刺激后内皮细胞培养液上清液中vWF抗原含量明显升高。与GAG共同作用时，GAG对活化内皮细胞vWF抗原释放反应呈抑制作用，在1mg／L～5mg／L浓度范围内抑制活性逐步增强，GAG5mg／L时达到最大抑制活性。但是随着GAG浓度的进一步升高，抑制活性反而呈下降趋势。虽然与GAG共同作用时HUVECs内vWF抗原含量较凝血酶单独作用时增高，但总体vWF抗原含量（细胞培养上清液中+细胞内）在GAG5mg／L时仍呈现为最低水平。GAG对凝血酶活化HUVECs PAI-1抗原表达的影响与对vWF抗原的作用相仿，对增强的PAI-1抗原表达呈抑制作用，在GAG5mg／L时抑制作用达到最大程度。同肝素相比，相同剂量的GAG对两种抗原释放反应的抑制作用较强。同时GAG可以抑制活化HUVECs vWF和PAI-1mRNA的转录活性。同凝血酶组相比，GAG浓度为4mg／L和5mg／L时，对vWF mRNA转录的抑制作用具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），且GAG5mg／L时抑制作用最为明显；对PAI-1 mRNA转录的抑制作用在GAG5mg／L时具有统计学意义（P＜0.05）。肝素5mg／L虽然对两种抗原mRNA转录亦呈抑制表现，但对PAI-1 mRNA转录的抑制作用无统计学意义。结论GAG可能通过降低活化HUVECs vWF和PAI-1抗原表达及其mRNA转录，调节活化血小板粘附分子GPⅠb和GPⅡb／Ⅲa复合物表达，抑制活化血小板与内皮细胞的粘附反应，抑制血栓形成。因此虽然体外实验中GAG不是一种有效的抗血小板聚集剂，但是我们的实验显示它可能是一种有效的抗血小板粘附剂。

论文目录

• 英文缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 正文
• 第一部分 GAG对血小板-内皮细胞粘附反应的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 GAG调节血小板粘附受体表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 GAG抑制内皮细胞促栓因子表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 在校期间发表论文
• 致谢