组织因子介导Genistein复合物靶向抗癌作用的实验研究

论文摘要

流行病学调查显示,东亚地区人群中乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等的发生率和死亡率均低于欧美国家,且与东亚地区居民食用较多的豆制品有一定关系。后分析发现大豆中含有丰富的异黄酮类化合物,天然的大豆异黄酮共有12种,其中5,7,4’-三羟基异黄酮（genistein,Gen）是发挥药理作用最重要的成分之一,其化学结构类似雌激素,且有低雌活性,故又称其为植物雌激素。近年来,大量研究证实Gen具有广泛的抗癌作用,其作用机制包括特异性抑制蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）,抑制拓扑异构酶Ⅱ活性,抑制肿瘤血管生成,促进肿瘤细胞分化等,高浓度的Gen（≥60μM）还可引起肿瘤细胞G2/M周期阻滞、诱导肿瘤细胞凋亡。同时本所前期研究显示Gen还具有一定的造血辐射防护效果,可以与肿瘤放疗产生协同作用。因此Gen是一种极有价值的潜在抗癌化合物。但由于Gen在体内分布特异性不强,必须大剂量使用才能达到有效杀伤肿瘤细胞浓度,而量大又有累积性雌活性增高之弊。如果选定肿瘤细胞高表达的某种受体,将Gen与其特异性配体连接,利用配体—受体特异性结合的特性,将Gen带入肿瘤局部形成高浓度,就可以在有效杀伤肿瘤细胞的同时减少Gen对非瘤组织的副作用。组织因子（tissue factor,TF）,又称凝血因子Ⅲ,是一种跨膜糖蛋白受体,能够识别和结合凝血因子Ⅶ（factorⅦ,fⅦ）,启动外源性凝血反应。近年来众多临床观察及体内、外实验均证实:TF在肿瘤的血管内皮细胞和许多恶性肿瘤如结肠癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等细胞表面存在高表达,导致肿瘤患者血液凝固性增高,并具有促进肿瘤生长、浸润、转移的作用。由于正常血管内皮细胞表面并不表达TF,所以能够与TF结合的配体经静脉注射进入体内后主要与肿瘤的血管内皮细胞结合,聚集在肿瘤组织局部。因此,TF堪称靶向抗癌药一个很好的作用“靶点”。国外研究学者最近为研究TF胞外区的关键酶促反应区域,从M13噬菌体二硫键限制的七肽库中成功筛选出一类含谷氨酸（E）和精氨酸（R）,即-ECLRSVVTC-模序的环形多肽,此类多肽能够与TF结合但不会引发外源性凝血,这为利用TF实现靶向抗癌提供了理论依据和技术途径。基于以上文献依据和构思设想,本课题拟设计、合成一种能够与TF特异结合且无凝血活性的小分子多肽,通过异型双功能交联剂将此多肽与Gen交联,构建成一种新的靶向抗癌复合物,以达到有效提高Gen抗癌治疗指数的目的。目前,尚无类似研究报道。研究内容主要分四个部分:1.检测TF在各种类型癌组织和对照癌旁组织中的表达,明确TF的分布特性。2.设计、合成能够与TF特异性结合的小分子多肽,命名为FHS001。然后通过化学交联剂Sulfo-SANPAH将FHS001与Gen进行化学交联,制备FHS001-Gen复合物。3。分别用99mTc和125I标记FHS001-Gen和Gen,示踪分析FHS001-Gen的体内分布。4.检测FHS001-Gen复合物的体外、体内抗癌作用。获得的主要实验结果如下:1.采用免疫组织化学染色法检测了55例来自附属西南医院的病人癌组织切片。在癌组织中都能够检测到TF的表达,阳性率高达96.4%,且以强阳性（+++）居多,所有不同亚型结直肠癌17例、胃癌11例、肺癌6例的肿瘤细胞表面和肿瘤血管内皮细胞表面均有TF的特异性高表达。结果说明癌细胞表面和肿瘤血管内皮细胞表面有TF的特异性高表达;而检测的对照癌旁组织中TF仅在肾小球细胞和部分肠上皮细胞表面有表达,正常血管内皮细胞表面不表达TF。因此,TF可以用于作为靶向抗癌药物定位的一个新“靶点”。2.分别在-ECLRSVVTC-序列的两端加上保护性氨基酸:甘氨酸（G）。为方便交联反应在末端各加上一个赖氨酸（K）和酪氨酸（Y）。序列中两个半胱氨酸（C）之间的二硫键形成环化分子,采用固相合成法成功合成所设计的小分子多肽-FHS001,序列为GECLRSVVTCGGKY,分子量为1469.7 Da。正常人血浆和乏fⅦ人血浆分别加入不同浓度的FHS001后,测定凝血酶原时间（PT）,高浓度的FHS001对正常人血浆和乏FⅦ人血浆的PT没有明显影响,PT实验证实其没有凝血活性。荧光显微镜观察发现FITC标记的FHS001加入体外细胞培养体系后,高表达TF的人乳腺癌MCF-7细胞表面有绿色荧光显示,而低表达TF的人血管内皮细胞ECV-304表面基本无荧光显示。提示FHS001与细胞表面TF胞外区能够很好地结合,因此FHS001可以作为抗癌药物的靶向载体。3.FHS001与Gen的交联反应分两步进行:第一步将过量的化学交联剂Sulfo-SANPAH与FHS001在PH=7.0的缓冲液中交联,此时Sulfo-SANPAH一端的N-琥珀酰亚胺酯活性基团释放出N-羟基琥珀酰亚胺,水解活化,并与FHS001中赖氨酸的ε-氨基形成稳定的酯键结构。第二步另一端的硝基苯基叠氮在特定波长的UV照射下解离活化成活性芳香氮基团,FHS001-SANPAH与Gen 7位上的羟基交联。反应完毕经HPLC纯化、质谱鉴定获得最终产物FHS001-Gen,复合物纯度>95%;质谱鉴定其相对分子量为1973.4 Da,推算其分子中FHS001载体与药物Gen的摩尔比为1:1。4.采用直接标记法成功获得99mTc标记的FHS001-Gen和125I标记的Gen,两种产物的放射比活性分别为932 KBq/μg和336 KBq/μg,放化纯度分别为96.5%和98.7%,可以用于体内分布实验的研究。5.体内分布实验以荷MCF-7皮下移植瘤裸鼠为实验对象,裸鼠尾静脉给药后分别于10min、30 min、60 min、120 min、240min等各时相点取材,测定肿瘤及血液、肝、肾、肠、肺等各组织的放射性,计算肿瘤（T）与非肿瘤组织（NT）的放射性比值。结果99mTc-FHS001-Gen尾静脉给药10 min后肿瘤及血液、肝、肾、肠、肺等各组织的放射性均达到峰值,之后逐渐下降。药物主要集中在肿瘤及血液、肝、肾等组织;肿瘤组织的放射性至60 min时高于除肾脏外的所有受检组织,T/NT比值在1.12-4.76之间,120 min时T/NT值达到最高,最大的瘤/肺比值达到4.87,有一定的肿瘤靶向性分布。相反125I-Gen给药后各组织中都有分布,肿瘤组织分布较少。30 min后各组织放射性达到高峰,但在各时相点肿瘤（T）放射性均显著低于血液、肝脏与肾脏（NT）（P<0.01）,说明Gen的分布没有肿瘤靶向性。99mTc-FHS001-Gen组肿瘤组织的比放射性明显高于相应时相点的125I-Gen组动物,因此复合物提高了Gen在肿瘤组织的分布。6.采用MTT法检测了不同浓度的FHS001-Gen和Gen对人乳腺癌细胞MCF-7细胞的生长抑制作用,结果FHS001-Gen在0.2-200.0μM的浓度范围内对MCF-7细胞均有不同程度的增殖抑制作用,抑制率均>16%,为16.3%-83.1%,且呈一定的剂量依赖性,药物浓度越大抑制作用越明显。Gen的浓度<20.0μM时,对MCF-7细胞的增殖抑制作用不明显,FHS001-Gen和Gen对MCF-7细胞的IC50分别为2.0μM和120μM,FHS001-Gen的效果明显优于未交联的Gen（P<0.05）。体内抑瘤实验表明,荷MCF-7皮下移植瘤裸鼠经尾静脉注射给药后,FHS001-Gen能够有效抑制MCF-7皮下移植瘤的生长,FHS001-Gen组的肿瘤抑制率达到61.9%,比Gen组（抑制率为44.6%）的抑瘤效果更好（P<0.05）。免疫组织化学染色结果空白对照组、Gen给药组和FHS001-Gen给药组的MVD分别为48.0±11.2/HP、24.6±5.5/HP和16.2±4.7/HP,给药组瘤内血管密度均明显小于空白对照组（P<0.01）。FHS001-Gen给药组效果较Gen给药组更为突出,相差显著（P<0.05）。FHS001-Gen对肿瘤血管的破坏可能是其发挥抗癌作用的一个重要因素。研究结论如下:1.TF在多种不同类型的癌细胞和肿瘤血管内皮细胞表面均有高表达,是一个值得关注的抗癌新“靶点”。2.我们针对TF设计、合成的小分子多肽-FHS001,没有凝血活性且保留了与TF的结合活性,与同类载体相比具有一定优势。3.采用化学交联的方法可以有效制备Gen的复合物:FHS001-Gen。4.体内分布实验证明FHS001-Gen组有更多的药物聚集在肿瘤组织局部,有利于药物选择性的发挥作用。5.FHS001-Gen复合物既保持了Gen的抑瘤活性与又保持了与TF的结合活性,与FHS001偶联后,Gen的体内外抗癌作用明显增强。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 组织因子介导Genistein复合物靶向抗癌作用的实验研究
• 前言
• 第一部分 组织因子在人肿瘤组织中的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 靶向Gen复合物的合成及纯化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 FHS001-Gen复合物的体内分布研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 FHS001-Gen复合物的抗癌作用研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述一 靶向性抗癌药物载体的研究进展
• 参考文献
• 文献综述二 组织因子与抗癌药物的研究
• 参考文献
• 博士期间发表文章情况