小麦全蚀病菌胞外β-1，3-葡聚糖酶的分离纯化及其在致病过程中的免疫标记定位

论文摘要

小麦全蚀病是我国及世界小麦生产中的重点防治对象。由于全蚀病是土传病害,利用化学药剂防治较难;其致病机理目前仍不明确,加之缺少有效的抗性品种,全蚀病的防治仍是小麦生产中的一大难题。因此,明确小麦全蚀病菌的致病本质,是制定防治策略的根本依据。本研究在生物化学、细胞学及细胞化学水平研究了小麦全蚀菌的致病机理,分离纯化了全蚀病菌产生的胞外β-1, 3-葡聚糖酶,并研究酶学性质,探索了该酶与病菌致病性的关系,取得以下重要研究结果:1)通过对小麦全蚀病菌产胞外β-1, 3-葡聚糖酶液体培养基中的氮、碳源进行筛选,发现较利于产酶的氮、碳源分别为以牛肉膏和小麦叶片,在病菌培养7 d时,培养液中酶活性水平为0.072 U/mL,基本达到以牛肉膏和小麦麸皮分别为氮、碳源的组合21 d时的水平（0.074 U/mL）。2)利用硫酸铵沉淀（60%饱和度）、疏水层析（Phenyl-Sepharose）、阴离子交换层析（DEAE-sepharose）及凝胶过滤层析（Superdex200 10/300 GL）技术从小麦全蚀病菌培养滤液中分离纯化出一种胞外β-1, 3-葡聚糖酶,命名为GluGgt,经电泳检测达到电泳纯级别。3)利用非变性PAGE及SDS-PAGE分析发现,GluGgt在天然状态下存在2种Isoforms,Ia和Ib;由2种亚基组成,分子量分别为66.2 KD和56.0 KD。Ia和Ib经IEF电泳分析发现,其等电点分别为6.3和6.4。GluGgt经非变性PAGE及过碘酸/希夫染色鉴定为糖蛋白。4) GluGgt的最适反应温度约为50℃,在≤60℃时比较稳定;最适反应pH值约为5.0,pH 4.0-7.0较稳定;Mn2+对其酶活力有显著的激活作用,而Co2+,Hg2+和KMnO4对其酶活力有明显的抑制作用,EDTA对酶活性有轻微的抑制作用,而其他的离子如Fe3+,Mg2+,Zn2+,Ba2+,Ca2+和Cu2+对酶活性没有明显的影响。由Lineweaver-Burk法求得该酶对昆布多糖的Km为4.91 mg/ml,Vmax为0.111 mg/ml/min。5)利用TLC法分析GluGgt作用昆布多糖不同时间的产物,结果显示其为外切β-1, 3-葡聚糖酶,能水解含有β-1,3-糖苷键的多糖及Salicin,对ρNPG及含α/β-1,4-/β-1,6-糖苷键的多糖水解较慢或没有水解活性。6)以GluGgt为抗原,通过免疫接种实验兔的方法制备了抗血清（AS-GluGgt）,并纯化了该酶的特异性抗体（Anti-GluGgt）;经琼脂双扩散实验、Elisa以及Western杂交分析,制备的抗体具有较高的效价,并对GluGgt有较高的特异性。7)免疫胶体金标记发现GluGgt分布于皿内培养菌丝的细胞壁及胞内的膜状结构上;病菌在整个侵染过程中产生并分泌胞外β-1, 3-葡聚糖酶,酶标记位点除菌丝细胞壁外还分布于入侵菌丝附近的寄主细胞壁及木质管中,表明病菌胞外β-1, 3-葡聚糖酶到达寄主β-1, 3-葡聚糖沉积部位,参与寄主防御结构的降解。本研究首次分离纯化了小麦全蚀病菌产生的一种胞外β-1, 3-葡聚糖酶,并研究了其部分酶学性质;观察了在病菌-寄主互作过程中该酶分布,发现它在病菌侵染过程中可能参与了寄主细胞壁及防御结构（木质管）中β-1, 3-葡聚糖的降解,在病菌的侵染过程中起到一定的作用。在细胞化学水平初步明确了小麦全蚀病菌产生的胞外β-1,3-葡聚糖酶与致病过程的关系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦全蚀病
• 1.1.1 小麦全蚀病的发生与危害
• 1.1.2 小麦全蚀病菌变种类型
• 1.1.3 小麦全蚀病菌的侵染与定殖过程
• 1.1.4 小麦全蚀病菌致病机理
• 1.2 植物抗病机制研究现状
• 1.2.1 植物的抗病反应
• 1.2.2 植物抗病性的机制
• 1.3 植物病原真菌产生的降解酶以及毒素在致病过程中的作用
• 1.3.1 植物病原真菌产生的降解酶及其在致病过程中的作用
• 1.3.2 植物病原真菌毒素及其在致病过程中的作用
• 1.4 植物病原真菌Β-1,3-葡聚糖酶在致病过程中的作用研究策略
• 1.4.1 酶的分离纯化技术
• 1.4.2 免疫组织化学及胶体金免疫电镜技术
• 1.4.3 基因敲除技术
• 1.5 选题的依据、目的和意义
• 第二章 不同碳、氮源组合对小麦全蚀病菌产胞外Β-1,3-葡聚糖酶的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 基础培养基
• 2.1.3 供试碳源
• 2.1.4 供试氮源
• 2.1.5 主要化学试剂及来源
• 2.1.6 培养方法
• 2.1.7 酶液的提取
• 2.1.8 酶活性测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 以小麦组织为碳源对产酶的影响
• 2.2.2 以玉米组织为碳源对产酶的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 小麦全蚀病菌胞外Β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化和部分性质研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要化学试剂及来源
• 3.1.2 菌种及培养
• 3.1.3 酶活力及蛋白含量的测定
• 3.1.4 酶的分离与纯化
• 3.1.5 酶性质的研究
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 β-1,3-葡聚糖酶的纯化
• 3.2.2 胞外β-1,3-葡聚糖酶部分性质
• 3.3 讨论
• 第四章 小麦全蚀病菌胞外胞外1,3-Β-葡聚糖酶的抗体制备及部分性质
• 4.1 材料及方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 抗血清及抗体的免疫学性质
• 4.2.2 抗体的纯化及SDS-PAGE 电泳分析
• 4.2.3 小麦全蚀病菌胞外β-1, 3-葡聚糖酶抗体特异性检测
• 4.4 讨论
• 第五章 小麦全蚀病菌侵染麦根过程中胞外1,3-Β-葡聚糖酶的免疫标记定位
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 主要化学试剂及来源
• 5.1.2 菌种及接种
• 5.1.3 取样及组织超薄切片制备
• 5.1.4 胶体金免疫标记
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 无菌培养菌丝中1, 3-β-酶的免疫标记定位
• 5.2.2 病菌（Ggt）侵染麦根过程中1,3-β-酶的免疫标记定位
• 5.3 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介