重叠延伸PCR（SOE PCR）技术在洛伐他汀九酮合成酶基因克隆中的应用

论文摘要

重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR）是一种采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。洛伐他汀（lovastatin,也称莫那可林K,monacolin K）是一种来源于微生物HMG-COA（羟甲基戊二酰辅酶A）还原酶抑制剂,是用于治疗高胆固醇症的药物,它能阻止动脉硬化,减少心肌梗塞等发病的危险,因此在医学上具有重要意义。为了验证重叠PCR技术在洛伐他汀九酮合成酶基因（LOVB）克隆中的应用,本研究设计了4对引物,分别扩增LOVB的4个外显子,并按一定的顺序,利用重叠延伸PCR法将其4个外显子一一串联起来,形成LOVB①-④的cDNA序列,所得的DNA片段经纯化回收后与T克隆载体进行连接,然后转化至大肠杆菌DH5a中,最后用PCR法筛选阳性转化子,并用序列测定的方法鉴定重组质粒。结果表明：重叠延伸PCR成功扩增出了LOVB①-④的cDNA序列,大小1.3kb左右,该序列片段经纯化回收后与T克隆载体进行连接,然后转化至大肠杆菌DH5a中,在含氨苄青霉素（AMP）的LB平板上用PCR法筛选出了阳性菌落,测序结果和NCBI中登录号为AF151722.1的洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④的cDNA序列比对,同源性为98.5%,表明通过重叠延伸PCR技术成功克隆了LOVB①-④的cDNA序列,并获得了洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④-TA重组质粒,为今后毕赤酵母表达洛伐他汀九酮合成酶基因奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 前言
• 1 重叠PCR技术的研究进展
• 1.1 重叠PCR技术的建立
• 1.2 重叠PCR技术的原理
• 1.3 重叠延伸PCR技术的特点
• 1.4 重叠PCR技术的应用
• 1.4.1 重叠PCR克隆融合基因
• 1.4.2 重叠PCR克隆突变基因
• 1.4.3 重叠PCR用于基因敲除
• 1.4.4 重叠PCR扩增目的基因
• 1.5 展望
• 2 洛伐他汀的研究进展
• 2.1 洛伐他汀的发现
• 2.2 洛伐他汀的结构和理化性质
• 2.3 洛伐他汀的活性机理和药用价值
• 2.3.1 洛伐他汀的活性机理
• 2.3.2 洛伐他汀的调脂作用
• 2.3.3 洛伐他汀的非调脂作用
• 2.4 洛伐他汀生物合成酶
• 2.5 洛伐他汀生物合成机理
• 2.6 洛伐他汀生产工艺研究现状
• 2.7 他汀类药物的市场前景
• 2.8 他汀类药物展望
• 3 本研究的目的和意义
• 4 本研究的技术路线
• 第二章 材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 菌株
• 1.3 主要试剂
• 1.4 培养基及实验试剂配制
• 1.4.1 LB固体培养基
• 1.4.2 Czapek's液体培养基
• 1.4.3 土曲霉DNA提取相关试剂
• 2 实验方法
• 2.1 模板的制备
• 2.1.1 土曲霉菌体的培养
• 2.1.2 材料处理和粗提
• 2.1.3 纯化
• 2.1.4 电泳分析
• 2.2 LOVB基因引物设计
• 2.3 目的DNA片段的获得
• 2.3.1 重叠PCR扩增
• 2.3.2 重叠PCR扩增影响因素的比较
• 2.4 目的DNA片段和T克隆载体的连接
• 2.5 氯化钙法制备大肠杆菌DH5a感受态细胞
• 2.6 大肠杆菌DH5a的转化
• 2.7 转化子的检测和鉴定
• 2.7.1 PCR快速筛选
• 2.7.2 重组质粒的测序
• 第三章 实验结果
• 1 土曲霉总DNA的提取
• 2 目的基因的PCR扩增结果
• 2.1 第一轮PCR的扩增结果
• 2.2 第二轮PCR的扩增结果
• 2.3 第三轮PCR的扩增结果
• 2.4 重叠PCR扩增影响因素的比较结果
• 2+浓度的比较结果'>2.4.1 不同退火温度和Mg²⁺浓度的比较结果
• 2.4.2 三段或两段DNA片段拼接的比较结果
• 2.4.3 直接和间接模板应用的比较结果
• 2.4.4 模板纯化和不纯化的比较
• 3 重组质粒的菌落PCR鉴定结果
• 4 重组质粒的序列测定结果
• 第四章 讨论
• 1 重叠延伸PCR克隆洛伐他汀九酮合成酶基因LOVB①-④的cDNA序列
• 2 重叠引物的设计
• 3 重叠延伸反应条件
• 4 DNA聚合酶的选择
• 5 PCR产物的纯化回收
• 6 本实验需进一步完善的地方
• 第五章 小结
• 参考文献
• 附录一 培养基和试剂配方
• 附录二 琼脂糖凝胶回收步骤
• 附录三 质粒的小量提取
• 附录四 重组质粒的测序结果
• 致谢