F5菌毛基因的克隆、表达及单克隆抗体的制备

论文摘要

由产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）引起的仔猪、犊牛和羔羊腹泻是幼畜的一种最常见病,在世界范围造成严重的经济损失。ETEC菌株的致病前提是通过细菌表面的黏附素与宿主黏膜上皮细胞表面的相应受体结合,从而在该局部组织定居、繁殖、产生毒素或侵入深部损伤或破坏组织,引起疾病或造成隐性感染。而F5+ETEC是引起仔猪腹泻病的重要病原菌之一,因而对F5菌毛进行深入研究具有重要的理论及现实意义。本研究根据已发表的F5菌毛基因序列设计引物,用PCR扩增法从F5+参考菌株中扩增出496bp的基因序列,通过测序和序列分析比较,所获核苷酸序列与己发表的F5菌毛基因序列同源性达到99.8%。将不含信号肽的F5基因片段按正确的阅读框架克隆入pET-30a（+）表达载体中,用IPTG诱导实现其在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE电泳和Western-blotting结果显示,表达的融合蛋白约为23ku。将原核表达产物经Ni-NTA柱提纯后免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,采用间接ELISA筛选出一株稳定分泌针对F5基因的杂交瘤细胞,Western blot结果表明该杂交瘤细胞培养上清与融合表达的F5蛋白具有良好的反应性。特异性鉴定显示本研究制备的单克隆抗体与受试大肠杆菌（F4+、F6+）无交叉反应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 大肠杆菌与仔猪疾病
• 1.2 ETEC 菌毛与细菌黏附
• 1.2.1 F4 菌毛
• 1.2.2 F18 菌毛
• 1.2.3 F41 菌毛
• 1.2.4 F6 菌毛
• 1.2.5 F5 菌毛
• 1.3 F5 菌毛检测方法研究进展
• 1.4 F5 菌毛单克隆抗体的研究进展
• 1.5 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株、血清和质粒
• 2.1.2 酶及其他试剂
• 2.1.3 实验动物及细胞系
• 2.1.4 主要溶液其配制方法
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 F5 菌毛蛋白基因的克隆与表达
• 2.2.2 单克隆抗体的制备
• 3 结果
• 3.1 F5 基因的克隆及其重组质粒的鉴定
• 3.2 重组表达质粒的构建与鉴定
• 3.3 F5 重组菌毛蛋白基因的表达
• 3.4 重组蛋白的Western blot检测
• 3.5 筛选方法的建立
• 3.5.1 包被抗原、抗体最佳工作浓度的确定
• 3.5.2 一抗作用时间的确定
• 3.5.3 酶标二抗作用时间的确定
• 3.5.4 底物作用时间的确定
• 3.6 杂交瘤细胞的筛选
• 3.7 单克隆抗体的WESTERN BLOT 鉴定
• 3.8 特异性鉴定
• 3.9 单克隆抗体Ig亚型鉴定
• 3.10 杂交瘤细胞染色体分析
• 3.11 杂交瘤分秘抗体稳定性鉴定
• 4 讨论
• 4.1 免疫原的制备
• 4.2 单克隆抗体的应用
• 4.3 ETEC F5重组菌毛蛋白及其McAb在ETEC病研究中的展望
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文