青花菜抗病基因同源序列及相关基因的克隆与表达分析

论文摘要

本文对青花菜抗病相关基因β-1，3-葡聚糖酶基因进行克隆，并对抗病基因同源序列进行了相关研究．主要内容如下：1．青花菜β-1，3-葡聚糖酶基因的克隆、表达分析及其植物表达载体的构建根据其他植物的β-1，3葡聚糖酶基因保守域序列设计兼并引物，扩增出青花菜β-1，3葡聚糖酶基因的中心区段，结合5′RACE和3′RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列，经序列拼接获得了一个1277bp的cDNA，在GenBank中登录号为EF484879，定名为BObg。序列分析结果表明，该cDNA包含一个1056bp的开放读码框，编码352个氨基酸，其理论上的等电点PI=7．314，分子量MW=38．92KD，进化树分析显示该序列与已报道的其他植物的β-1，3葡聚糖酶基因具有较高氨基酸序列同源性。利用未接种和接种霜霉病后不同时期的青花菜植株细胞进行半定量RT-PCR分析，结果表明，该基因在霜霉病接种后48小时优势转录表达，未接种和接种后其它时期都呈低水平转录表达。利用PBI121质粒构建含35S启动子的正义表达载体，酶切图谱和PCR分析结果证明该表达载体构建成功。2．青花菜抗病基因同源序列的克隆与表达分析根据已克隆抗病基因（R-gene）与病程相关蛋白基因（PR）的保守域设计引物，对青花菜基因组DNA进行PCR扩增。获得了4个片段。同源性比较发现，该4个片段均属于NBS-LRR类抗病基因同源序列（RGA），与已知R基因相应区段的氨基酸序列高度同源。与已知抗病基因聚类分析结果显示，该4个RGA序列属于不同类别。本研究成功获得了青花菜RGA序列，为进一步克隆青花菜的R基因奠定了基础。这些RGA既可进一步用于筛选青花菜的抗病候选基因，同时也可以作为分子标记，用于青花菜遗传图谱的构建。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 植物抗病性及基因克隆研究进展
• 1 植物抗病基因同源序列的研究进展及应用
• 2 植物抗病基因的结构与分类
• 2.1 NBS-LRR类
• 2.2 LRR-TM-STK类
• 2.3 LRR-TM类
• 2.4 STK类
• 2.5 TM类
• 2.6 其他类型
• 3 RGA与R基因之间的关系
• 4 防卫反应基因及其应用
• 4.1 与植保素合成有关的基因
• 4.2 病程相关蛋白基因
• 4.2.1 β-1,3-葡聚糖酶基因及其应用
• 4.2.2 几丁质酶基因及其应用
• 5 同源序列候选基因克隆法在植物抗病基因克隆上的应用
• 参考文献
• 第二章 青花菜霜霉病及其抗病育种的研究进展
• 1.青花菜霜霉病的病原菌
• 2.青花菜霜霉病的症状
• 3.青花菜霜霉病传播途径及发生条件
• 4.青花菜霜霉病的抗病性遗传
• 5.青花菜的抗病机制
• 5.1 青花菜的物理抗性
• 5.2 青花菜的化学抗性
• 6.青花菜抗病分子育种
• 6.1 杂种优势利用研究
• 6.1.1 自交不亲和系选育和利用
• 6.1.2 雄性不育系选育的研究
• 6.2 生物技术在青花菜育种上的应用
• 6.2.1 组织培养的研究
• 6.2.1.1 器官培养
• 6.2.1.2 花药、花粉（小孢子）培养
• 6.2.1.3 原生质体培养与融合
• 6.2.1.4 突变体筛选
• 6.3 基因工程育种
• 6.4 分子标记研究
• 参考文献
• 第二部分 研究报告
• 第三章 青花菜β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆、表达分析及其植物表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 霜霉病菌
• 1.1.3 各种酶类
• 1.1.4 试剂盒
• 1.1.5 常用储液
• 1.2 方法
• 1.2.1 材料的准备
• 1.2.2 基因组DNA的提取
• 1.2.3 总RNA的提取（Trizol法）
• 1.2.4 去除总RNA中DNA污染
• 1.2.5 扩增产物的电泳,回收,克隆及测序
• 1.2.6 β-1,3-葡聚糖酶基因全长的获得
• 1.2.7 序列分析及系统进化树的构建
• 1.2.8 β-1,3 葡聚糖酶基因的霜霉病诱导表达分析
• 1.2.9 青花菜β-1,3 葡聚糖酶基因植物表达载体的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆和序列分析
• 2.2 β-1,3-葡聚糖酶基因的霜霉病诱导表达分析
• 2.3 β-1,3 葡聚糖酶基因植物表达载体的构建
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 青花菜抗病基因同源序列的克隆及分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 DNA的提取
• 1.3 引物设计和PCR扩增
• 1.4 扩增产物的电泳,回收,克隆及测序
• 1.5 序列分析与进化树的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 青花菜R基因同源序列的克隆鉴定
• 2.2 青花菜RGA序列的同源性比较与聚类分析
• 3 讨论与结论
• 3.1 利用简并引物需要注意的问题
• 3.2 青花菜NBS类RGAs的多样性
• 3.3 PCR法分离RGAs
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 附录