胆固醇在PAMAM介导的基因传递过程中的作用

论文摘要

聚酰胺-胺（PAMAM,polyamidoamine）以其独有的分子结构和物理特性,能够通过静电疏水等作用与DNA紧密结合,并将其缩聚,保护DNA不被降解,是近年来广泛使用的非病毒基因治疗载体。但是相比病毒载体,PAMAM的转染效率仍然很低,这是由于它在转染过程中存在多个屏障。对于PAMAM/DNA复合物与细胞结合并进入细胞的具体机制的理解,克服PAMAM转染过程的细胞膜屏障,将有助于我们找到提高PAMAM转染效率方法。本文采用卵磷脂脂质体模拟细胞膜骨架,并在其中加入胆固醇单组分,通过等温微量量热法,Zeta电势和透射电子显微镜,对PAMAM/DNA复合物与脂质体的相互作用进行考察,探索PAMAM/DNA复合物与脂质体膜的作用机制,以及胆固醇在其中所起到的作用。热力学研究表示,对于含有和不含有胆固醇的脂质体,PAMAM/DNA复合物主要通过静电作用与其表面结合,反应由焓驱动,胆固醇的加入将使结合在表面的PAMAM/DNA复合物能够嵌入脂双层中,从而引起焓变、熵变的增大,甚至出现聚集的吸热过程。PAMAM/DNA复合物的电荷比大于1时,脂质体的负电势随着PAMAM/DNA复合物的加入而减小,说明两者通过静电作用结合,胆固醇在静电结合的过程中没有作用。通过电镜观察,对于不加胆固醇的脂质体,PAMAM/DNA复合物结合在脂质体表面,可以看到两球结合的状态,对于加入胆固醇的脂质体,PAMAM/DNA复合物进入脂质体内部,脂质体粒径增大,仍为球状。各种检测均表明PAMAM/DNA复合物通过静电作用结合在表面后,通过胆固醇的作用进入细胞膜。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 基因治疗
• 1.1.1 基因治疗的概念
• 1.1.2 基因治疗的策略
• 1.1.3 基因治疗的步骤
• 1.1.4 基因治疗的发展及现状
• 1.2 基因传递载体
• 1.2.1 病毒载体
• 1.2.2 非病毒基因载体
• 1.3 阳离子聚合物载体PAMAM
• 1.4 阳离子聚合物/DNA 复合物基因传递过程
• 1.4.1 细胞外屏障
• 1.4.2 细胞膜屏障
• 1.4.3 细胞内屏障
• 1.5 检测手段
• 1.5.1 等温滴定量热法
• 1.5.2 Zeta Potential
• 1.5.3 透射电子显微镜
• 1.6 本文的主要工作
• 第二章 质粒的提取和纯化
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 主要试剂和仪器
• 2.2.2 所用溶液的配制
• 2.2.3 实验菌种和质粒
• 2.2.4 菌体培养
• 2.2.5 质粒提取
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.2 核酸仪检测
• 2.4 本章小结
• 第三章 单室脂质体的制备
• 3.1 引言
• 3.1.1 脂质体及其分类
• 3.1.2 脂质体的结构
• 3.1.3 脂质体的制备
• 3.2 脂质体的组成体系
• 3.2.1 卵磷脂
• 3.2.2 胆固醇
• 3.3 实验试剂和设备
• 3.4 实验方法
• 3.4.1 脂质体的合成
• 3.4.2 脂质体的显微形态的测定
• 3.4.3 脂质体粒径和Zeta 电势的测定
• 3.4.4 脂质体稳定性的测定
• 3.4.5 脂质体的保存
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 脂质体形态的观察
• 3.5.2 粒径分布
• 3.5.3 电势分布
• 3.5.4 稳定性参数
• 3.5.5 脂质体的保存
• 3.6 小结
• 第四章 DNA 复合物与脂质体相互作用的热力学研究
• 4.1 引言
• 4.1.1 ITC 工作原理
• 4.1.2 ITC 应用范围
• 4.1.3 ITC 特点
• 4.2 实验设备与材料
• 4.2.1 实验试剂与设备
• 4.2.2 实验材料
• 4.3 实验方法与步骤
• 4.3.1 实验方法
• 4.3.2 实验条件
• 4.3.3 实验步骤
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 稀释热的确定
• 4.4.2 PAMAM 与脂质体的等温滴定量热实验
• 4.4.3 DNA 与脂质体的等温滴定量热实验
• 4.4.4 DNA 复合物与SPC 脂质体的等温滴定量热实验
• 4.4.5 DNA 复合物与SPC/Chol 脂质体的等温滴定量热实验
• 4.5 本章小结
• 第五章 DNA 复合物与脂质体相互作用的其它检测
• 5.1 引言
• 5.1.1 Zeta 电势
• 5.1.2 透射电子显微镜
• 5.2 实验设备与材料
• 5.2.1 实验设备
• 5.2.2 实验材料
• 5.3 实验方法与步骤
• 5.3.1 Zeta 电势的测定
• 5.3.2 透射电镜观察
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 Zeta 电势检测结果
• 5.4.2 透射电镜观察结果
• 5.5 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 全文结论
• 6.2 建议和展望
• 参考文献
• 致谢