植物纤维素合酶基因片段的克隆、鉴定及序列分析

论文摘要

纤维素是由纤维素合酶催化合成的天然多糖物质，是地球上最丰富的生物大分子和重要的可再生资源，是植物细胞壁的主要成分。纤维素是纸浆、造纸工业最重要的天然材料，是潜在的生物能源。生物体内众多的纤维素合酶基因编码了一个庞大的纤维素合酶家族，它们共同催化了生物体内所有纤维素的合成。本实验利用CTAB法提取了欧美杨107（Populus×euramericana cv.“74/76”）的基因组DNA；经Primer Premier5.0软件设计了两对引物用于纤维素合酶基因（CesA）的扩增，通过对影响PCR扩增的因素（退火温度、引物、dNTP、DNA模板等）的优化，确定了CesA基因PCR扩增的最适引物和反应体系。从欧美杨107的次生木质部中提取总RNA，经RT-PCR扩增，在退火温度为55℃时，扩增得到三条DNA片段，大小分别为2700bp、1500bp、800bp左右。将目的DNA片段回收并与pMD20-T载体连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，在含有Amp、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上培养，筛选出白色单菌落。提取白色单菌落中的质粒、并进行特异引物扩增、限制性内切酶酶切和测序鉴定。对克隆片段的测序分析结果显示，目的片段正向插入到了pMD20-T载体中，大小为883bp。该片段与Populus tremula×Populus tremuloides纤维素合酶基因CesA1的同源性高达99%。对其拟表达氨基酸的序列分析显示，该片段编码了纤维素合酶保守的锌指结构和两个跨膜区域，确定该片段是纤维素合酶基因片段，并将其登录到GenBank，登录号为AM921697；此外，将构建的CesA质粒命名为pMD20-T-CesA并留实验室保存作后续研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 纤维素的生物合成
• 1.2.1 纤维素的种类
• 1.2.2 纤维素的生物合成
• 1.2.2.1 细菌纤维素的合成
• 1.2.2.2 植物纤维素的合成
• 1.3 纤维素合酶
• 1.3.1 催化纤维素生物合成的纤维素合酶复合体
• 1.3.2 纤维素合酶的发现及结构特点
• 1.4 纤维素合酶基因
• 1.4.1 纤维素合酶基因的鉴定
• 1.4.2 高等植物中 CesA 基因功能分析
• 1.4.3 植物体内 CesA 基因的由来
• 1.4.4 纤维素合酶超家族
• 1.5 采用杨树进行纤维素生物合成研究的重要意义
• 1.5.1 杨树——林木基因组学研究的模式物种
• 1.5.2 良好的纸浆原料
• 1.5.3 重要的生物能源
• 1.6 当前杨树纤维素合酶基因研究水平
• 1.6.1 杨树中 CesA 基因的鉴定
• 1.6.2 杨树中 CesA 基因的表达分析
• 1.7 本论文的研究目的
• 1.8 拟采取的实验试验方法和路线
• 第二章 杨树基因组 DNA 的提取及 CesA 基因扩增引物的筛选
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 试剂的配制
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 杨树基因组 DNA 提取
• 2.2.1.1 2×CTAB 法提取 107 杨基因组 DNA
• 2.2.1.2 简化的 SDS 法提取 107 杨基因组 DNA
• 2.2.2 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 质量
• 2.2.3 引物的设计
• 2.2.4 CesA 基因扩增条件的优化
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 不同方法提取杨树基因组 DNA 的比较、分析
• 2.3.2 CesA 基因扩增条件的优化
• 2.4 讨论
• 第三章 杨树次生木质部总 RNA 的提取及 RT-PCR 扩增
• 3.1 材料、试剂与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法与步骤
• 3.2.1 107 杨次生木质部总 RNA 的提取
• 3.2.1.1 材料的处理
• 3.2.1.2 杨树次生木质部总 RNA 的提取
• 3.2.2 目的基因的 RT-PCR 扩增
• 3.2.3 目的片段的回收
• 3.2.4 1%琼脂糖凝胶电泳检测回收效果
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 107 杨次生木质部总 RNA 的提取结果
• 3.3.2 RT-PCR 扩增结果分析
• 3.3.3 回收片段检测
• 3.4 讨论
• 第四章 杨树次生木质部 CesA 基因片段的克隆、鉴定
• 4.1 实验材料、试剂与仪器
• 4.1.1 菌株和载体
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 目的片段与 pMD20-T 载体的连接
• 2法）'>4.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 4.2.3 重组质粒的转化
• 4.2.4 重组子的菌落 PCR 鉴定
• 4.2.5 重组质粒的小量提取与纯化
• 4.2.6 重组质粒的 PCR 扩增鉴定
• 4.2.7 重组质粒的双酶切鉴定
• 4.2.8 重组质粒的测序分析与鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 重组质粒的蓝白斑鉴定
• 4.3.2 菌落 PCR 鉴定结果
• 4.3.3 质粒提取检测结果
• 4.3.4 重组质粒的 PCR 扩增鉴定
• 4.3.5 重组质粒双酶切鉴定结果
• 4.3.6 重组质粒的测序鉴定
• 4.4 讨论
• 第五章 CesA 基因片段的序列分析鉴定及拟表达蛋白的结构预测
• 5.1 序列分析及蛋白结构预测
• 5.1.1 DNA 序列分析
• 5.1.2 氨基酸序列分析
• 5.1.3 遗传进化分析
• 5.1.4 二级结构预测
• 5.1.5 结构域、跨膜区分析
• 5.1.6 三级结构预测
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 克隆片段的序列分析
• 5.2.2 结构预测
• 5.2.3 讨论
• 第六章 结果与展望
• 6.1 实验结果
• 6.2 问题与展望
• 参考文献
• 致谢