稻瘟病菌两个假定G蛋白偶联受体的功能分析

论文摘要

稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）是研究丝状真菌的重要模式生物，也是引起水稻重要病害稻瘟病的病原菌。该菌侵染循环过程经历了分生孢子萌发、附着胞分化、侵入栓的形成以及侵染生长，这一过程涉及复杂的细胞分化、信号转导和极性生长。G蛋白偶联受体（GPCRs）作为一类细胞表面受体，在接受不同的外源信号中起重要作用，介导着对多种刺激物的应答。刺激信号包括：生物素、气味分子、光、神经递质、内分泌和旁分泌的激素、营养因子等等。DeZwaan等克隆了一个新的跨膜蛋白编码基因Pth11，与表面识别有关，Mpg1可能通过Pth11将其识别的疏水性信号传递给G蛋白，从而激活细胞内的cAMP和MAP蛋白激酶等信号途径。Kulkar（2005）用生物信息学的方法分析表明稻瘟病菌全基因组序列中有14个可能的GPCRs。特别是发现了61个与PTH11同源的GPCRs类似蛋白，这些蛋白在结构上含典型的多个跨膜区和N端胞外GPCRs结构域（即胞外富半胱氨酸的EGF类结构）。因此我们推测GPCRs和GPCRs类似蛋白可能在稻瘟病菌不同侵染时期可能参与识别不同的植物信号，在致病性调控过程及真菌与植物互作中起重要的作用。本研究选取其中的2个可能的GPCR基因MGG02855.5和MGG04698.5作为候选基因，通过基因敲除的方法构建基因失活突变体。研究这些突变体在生长、交配、产孢、附着胞形成、侵入和植物侵染生长中的表型，以野生型GUY11作对照。对于表型有明显差异的基因失活突变体进行互补，观察其表型是否恢复，从而确定该基因的功能。研究发现，MGG 04698.5基因的失活突变体在产孢、菌丝生长速度、菌丝颜色与野生型GUY11相比并无明显变化，但在疏水性表面孢子萌发、附着胞形成时间相对GUY11延迟：以相同浓度的孢子浓度接种水稻品种C039，突变体致病性比GUY11增强。MGG 02855.5基因的失活突变体产孢量明显比野生型GUY11减少，菌丝颜色变的更黑，气生菌丝也相对减少，而在生长速度、交配、孢子萌发、附着胞形成等方面无太大差别。将该基因及其启动子导入失活突变体，发现产孢量恢复到接近野生型水平，初步证实该基因的功能跟稻瘟病菌的产孢调控有关。综合对两个GPCR基因功能研究的结果，说明GPCRs基因参与调控稻瘟病菌的生长与致病过程，但是不同的GPCRs功能可能不同，进一步对该菌GPCRs功能的分析，将有利于加深对该菌侵染致病分子机制的认识。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 稻瘟病菌的生长发育及侵染致病的信号途径
• 1.1.1 稻瘟病菌的生长发育
• 1.1.2 稻瘟病菌致病过程中相关的信号途径
• 1.1.2.1 依赖于cAMP的蛋白激酶途径
• 1.1.2.2 MAP蛋白质激酶级联机制
• 1.2 G蛋白偶联受体（GPCR）的结构、功能及其主要研究进展
• 1.2.1 G蛋白
• 1.2.2 G蛋白偶联受体
• 1.2.2.1 GPCR的结构
• 1.2.2.2 GPCR的分类
• 1.2.3 GPCR与G蛋白的关系
• 1.2.4 GPCR的功能与应用
• 1.3 GPCR在不同生物中的研究情况
• 1.3.1 GPCR在细菌中的研究情况
• 1.3.2 GPCR在哺乳动物中的研究应用情况
• 1.3.3 GPCR在植物真菌中的研究情况
• 2 材料与方法
• 2.1 试验使用的菌株、质粒、试剂和培养基等材料
• 2.2 稻瘟病菌基因组DNA的提取
• 2.3 DNA琼脂糖电泳
• 2.4 PCR扩增（普通PCR、RT-PCR）
• 2.5 PCR产物的克隆
• 2.6 E.coliDH5α感受态细胞的制备
• 2.7 感受态细胞的转化
• 2.8 质粒DNA的提取
• 2.9 质粒酶切与连接
• 2.10 稻瘟病菌原生质体的制备
• 2.11 稻瘟病菌原生质体转化和转化子的验证
• 2.12 敲除突变体的互补
• 2.13 稻瘟病菌基因组DNA Southern杂交
• 2.13.1 探针的准备
• 2.13.2 稻瘟病菌基因组DNA的消化及电泳
• 2.13.3 Southern杂交
• 2.13.4 免疫显色
• 2.14 稻瘟病菌总RNA的提取与分析
• 2.15 稻瘟病菌突变体的表型观察
• 2.15.1 生长速率测定与菌落颜色
• 2.15.2 产孢量测定
• 2.15.3 孢子萌发率的测定
• 2.15.4 附着胞形成率及洋葱表皮侵入实验
• 2.15.5 对植物致病性的测定
• 2.15.5.1 水稻育苗及接种方法
• 2.15.5.2 大麦叶片离体接种
• 3 结果与分析
• 3.1 稻瘟病菌两个假定GPCR基因结构的生物信息学分析
• 02855和MGG₀4698基因敲除突变体的获得'>3.2 稻瘟病菌假定GPCRsMGG₀2855和MGG₀4698基因敲除突变体的获得
• 02855缺失突变体的互补'>3.3 基因MGG₀2855缺失突变体的互补
• 3.4 两个GPCR基因与稻瘟病菌生长发育以及致病性的关系
• 3.4.1 生长速度和菌丝颜色分析
• 3.4.2 产孢量测定
• 3.4.3 孢子萌发率、附着胞形成率及洋葱表皮侵入分析
• 3.4.4 致病性分析
• 3.4.5 RT-PCR分析GPCR与已知信号途径的关系
• 4 讨论与小结
• 参考文献
• 致谢