极地细菌Pseudomonas putida S1海藻糖合成酶的研究

论文摘要

海藻糖是两分子葡萄糖以α-1,1糖苷键连接形成的一种非还原性双糖。作为生物体重要的抗逆应激物,对生命体、生物膜和生物大分子具有非特异性保护作用。它独特的结构和生物学功能使得它在食品工业、医药工业、化妆品工业和农业等领域具有广泛的应用前景。海藻糖合成酶通过分子内的转糖苷作用转化麦芽糖生成海藻糖,它是海藻糖生物合成的重要途径,也是有工业应用价值的酶法生产海藻糖的重要方法之一。目前有关海藻糖合成酶的研究主要集中在高温和中温微生物中,对低温微生物所产海藻糖合成酶研究较少。极地具有极端低温、高盐度及干燥等独特的地理及气候特征,是低温微生物的重要来源。本论文从极地微生物中分离筛选产海藻糖合成酶的低温菌,并对其进行微生物学、分子生物学和酶学研究。本论文研究的目的,一方面是为了拓宽海藻糖合成酶产生菌的来源,获得具有自主知识产权的海藻糖合成酶产生菌,并为利用该菌工业化生产海藻糖提供理论指导,奠定技术基础;另一方面,也为进一步理解海藻糖合成酶在不同微生物中的生理作用、系统进化等提供一定的分子生物学及酶学信息。经过一系列的初筛、复筛和对产物的进一步验证,从83株极地土壤细菌和20株极地海洋细菌中筛选到一株产海藻糖合成酶的极地海洋细菌菌株S1。该菌株具有较强的将麦芽糖转化为海藻糖的能力,其粗酶液转化率为7076%,部分纯化酶约8082%。结合菌体形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析结果以及系统发育学特征,根据多相分类原则,将其鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida S1。对其生长特性的研究表明,该菌株为耐冷菌和耐盐菌。其所产的海藻糖合成酶属于低温碱性酶。在20℃培养20h后,对P. putida S1进行热激（25℃或30℃30min）或盐胁迫（加入0.50.6 mol/L的NaCl）处理,可以使其合成海藻糖合成酶的活性分别提高7076%和9092%。而对其进行冷激处理（5℃,0℃和-17℃,30min）未对菌株产海藻糖合成酶表现明显的促进作用。热激和盐胁迫协同处理未表现出明显的协同作用。以P. putida S1染色体DNA为模板,采用PCR技术,成功克隆了P. putida S1的海藻糖合成酶基因treS。基因序列分析结果显示,该基因开放阅读框大小为2067bp,编码的蛋白质分子含688个氨基酸残基,分子量约75.7KD。同Genbank数据库中已公开的海藻糖合成酶基因序列进行同源性比对分析结果表明,P. putida S1的海藻糖合成酶与Pseudomonas属细菌的海藻糖合成酶的基因序列和蛋白质序列同源性均在70%以上。但与其它已报道的一些海藻糖合成酶,如来自于Pimelobacter sp. R48和Thermus aquaticus的海藻糖合成酶同源性均低于30%。将菌株P. putida S1的treS基因与表达载体pQE30T连接并转化宿主菌E.coli M15,得到了过量表达P. putida S1 treS基因的重组菌E.coli M15/pQE30T-TS。该菌株经IPTG诱导表达后,其细胞裂解上清液中海藻糖合成酶活性高达18.1u/ml,比酶活为5.36u/mg蛋白,分别比原始菌株P. putida S1提高了50倍和120倍。该基因工程重组菌株显示出良好的应用前景。采用两次Ni-NTA亲和柱层析对重组海藻糖合成酶进行了纯化。对纯化的重组海藻糖合成酶的酶学性质研究结果显示,该酶最适作用温度25℃,酶在35℃以下稳定。最适作用pH为8.5,在pH7.59.0范围内稳定。1mmol/L的Hg2+,Cu2+, Fe3+,Zn2+对该酶活性有不同程度的抑制作用,Tris盐对重组海藻糖合成酶活性具有较强的抑制作用。重组海藻糖合成酶以麦芽糖为底物时,Km =10.2mmol/L,Vmax =27.0μmol/mg protein/min;而以海藻糖为底物时Km =87.5mmol/L,Vmax =26.0μmol/mg protein/min。表明该酶对麦芽糖的亲和性比对海藻糖的亲和性高。P. putida S1海藻糖合成酶在基因序列、蛋白质序列和酶学性质等方面与已报道的海藻糖合成酶均表现出一定的差异,表明该酶是一新酶。其基因序列已提交Genbank数据库,Accession Number:EU310374。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 海藻糖及其理化性质
• 1.1.1 海藻糖的发现及其化学结构
• 1.1.2 海藻糖的理化性质
• 1.2 海藻糖的功能
• 1.2.1 海藻糖的生理功能
• 1.2.2 海藻糖的其它功能
• 1.3 海藻糖的应用
• 1.3.1 海藻糖在食品工业中的应用
• 1.3.2 海藻糖在医药工业中的应用
• 1.3.3 海藻糖在化妆品工业中的应用
• 1.3.4 海藻糖在农业中的应用
• 1.4 海藻糖的生物合成
• 1.4.1 磷酸海藻糖合成酶/磷酸海藻糖磷酸酶途径（TPS/TPP Pathway）
• 1.4.2 麦芽寡糖基海藻糖途径（TreY/TreZ Pathway）
• 1.4.3 海藻糖合成酶途径（TS Pathway）
• 1.4.4 海藻糖磷酸化酶途径（TreP Pathway）
• 1.4.5 海藻糖转糖苷合成酶途径（TreT Pathway）
• 1.5 海藻糖的制备
• 1.5.1 抽提法制备海藻糖
• 1.5.2 发酵法生产海藻糖
• 1.5.3 海藻糖的酶法转化
• 1.6 海藻糖合成酶研究概述
• 1.7 低温酶和极地微生物
• 1.7.1 低温菌和低温酶
• 1.7.2 极地和极地微生物
• 1.8 论文研究的目的和内容
• 第二章 产海藻糖合成酶极地低温菌S1 的筛选与验证
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 产酶菌株的筛选流程
• 2.2.6 反应产物的验证
• 2.2.7 分析方法
• 2.2.8 菌种保藏方法
• 2.2.9 极地海洋菌S1 海藻糖合成酶的部分纯化
• 2.2.10 部分纯化的S1 海藻糖合成酶的反应特性
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 产海藻糖合成酶极地细菌的筛选
• 2.3.2 DNS 法对菌株S1 和S2 酶反应液还原性分析结果
• 2.3.3 菌株S1 酶反应产物的酶解特性
• 2.3.4 部分纯化的S1 海藻糖合成酶的作用底物
• 2.3.5 反应温度对S1 海藻糖合成酶活性的影响
• 2.3.6 不同缓冲体系对S1 海藻糖合成酶活性的影响
• 2.3.7 反应pH 对S1 海藻糖合成酶活性的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 海藻糖合成酶产酶菌株S1 的培养特性及分类鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 实验菌株与主要培养基
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 菌体形态特征观察
• 3.2.5 固体培养特征观察
• 3.2.6 菌株S1 生长温度范围和最适生长温度的确定
• 3.2.7 菌株S1 生长盐浓度范围的确定
• 3.2.8 生理生化试验
• 3.2.9 运动性检查
• 3.2.10 16S rDNA 序列测定与分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 S1 菌株的个体形态特征
• 3.3.2 S1 菌株的固体培养特征
• 3.3.3 菌株S1 生长温度范围和最适生长温度
• 3.3.4 NaCl 浓度对菌株S1 生长的影响
• 3.3.5 菌株S1 的生理生化特征
• 3.3.6 菌株S1 的16S rDNA 序列分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 环境胁迫对P. putida S1 产海藻糖合成酶的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 培养基
• 4.2.5 实验方法
• 4.2.6 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 P. putida S1 的的生长和产酶时间曲线
• 4.3.2 热激对P. putida S1 产海藻糖合成酶的影响
• 4.3.3 盐胁迫对P. putida S1 产海藻糖合成酶的影响
• 4.3.4 冷激对P. putida S1 产海藻糖合成酶的影响
• 4.3.5 热激和盐胁迫协同处理对P. putida S1 产海藻糖合成酶的影响
• 4.3.6 热激处理条件的优化
• 4.3.7 盐胁迫条件的优化
• 4.4 本章小结
• 第五章 P. putida S1 海藻糖合成酶基因在E.coli 中的克隆与表达
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 菌株与质粒
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 主要仪器
• 5.2.4 培养基与主要溶液
• 5.2.5 实验方法
• 5.2.6 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 P. putida S1 菌株treS 基因的PCR 扩增与TA 克隆
• 5.3.2 P. putida S1 菌株treS 基因的序列分析结果
• 5.3.3 重组质粒pQE30T-TS 的构建及其在E.coli M15 的表达
• 5.4 本章小结
• 第六章 重组海藻糖合成酶的分离纯化与酶学性质研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 菌株
• 6.2.2 主要试剂
• 6.2.3 主要仪器
• 6.2.4 培养基与溶液
• 6.2.5 实验方法
• 6.2.6 分析方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 重组海藻糖合成酶的分离与纯化
• 6.3.2 重组海藻糖合成酶的凝血酶酶切处理
• 6.3.3 重组海藻糖合成酶的最适作用温度和热稳定性
• 6.3.4 重组海藻糖合成酶的最适作用pH 和pH 稳定性
• 6.3.5 金属离子对重组海藻糖合成酶活性的影响
• 6.3.6 重组海藻糖合成酶的反应动力学参数
• 6.3.7 重组海藻糖合成酶与已报道海藻糖合成酶的比较
• 6.4 本章小结
• 论文主要结论
• 论文主要创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文
• 附录：附图