慢病毒介导RNAi技术培育抗新城疫病毒嵌合体鹅胚的研究

论文摘要

自1997年以来，在我国多数地区的鹅群中相继爆发和流行鹅副黏病毒病，经鉴定病原为血清Ⅰ型副黏病毒，即新城疫病毒，该病定名为鹅副黏病毒病，又可称为鹅新城疫。各种年龄的鹅对该病均易感，鹅群发病率平均为27.67%，死亡率个别可高达100%，平均死亡率为18.19%，且年龄越小其发病率和死亡率越高，给我国的养鹅业造成严重的经济损失。目前，鹅副黏病毒病防治主要以疫苗免疫为主，尽管目前有多种强毒疫苗和灭活疫苗用于免疫预防，但是仍然不能控制鹅副黏病毒病的发生。目前研究结果均表明，利用新城疫病毒强毒苗或灭活苗甚至是传统的LaSota弱毒疫苗来免疫预防鹅副黏病毒病均不能起到完全的免疫保护作用。因此，对于鹅副黏病毒病我们须寻求一种新的预防思路和技术手段。随着分子生物学及其技术方法的不断发展，基因阻断技术也得到了极大的发展，在哺乳动物或其他动物细胞中通过siRNA诱导RNAi效应来实现特定基因的有效抑制，该方法已经成为研究基因功能的重要工具。慢病毒载体介导的基因转导是近年来发展起来的技术，其突出的特点是具有较高的转染效率、能感染静止期细胞和较高的目的基因表达效率。本研究利用具有基因组整合特性和高侵染能力的慢病毒载体介导RNA干扰技术，研究其对鹅源新城疫病毒NA-1株在体外和体内复制增殖能力的影响，进而为禽类抗病毒研究奠定基础。首先针对鹅源新城疫病毒NA-1株NP、M基因保守区序列，分别设计3对shRNA，同时设计1对阴性对照shRNA序列，合成后退火形成双链，连接到双酶切线性化的带有pol Ⅲ U6启动子的慢病毒shRNA表达载体（pLKD-GFP），分别命名为：pLKD-shNP268、pLKD-shNP437、pLKD-shNP710、pLKD-shM168、pLKD-shM646、pLKD-shM1062及pLKD-control阴性对照，上述重组慢病毒干扰质粒经PCR及测序鉴定确认。将构建的不同重组慢病毒干扰质粒瞬时转染Vero细胞，48h后接种1000个TCID50/0.1mL的鹅源新城疫病毒NA-1株，分别于病毒感染的12h、24h、36h、48h，应用Real-time RT-PCR方法检测病毒基因mRNA表达量的变化，结果显示，重组慢病毒干扰质粒pLKD-shNP710及pLKD-shM646对病毒基因mRNA表达的抑制率分别为85.8%和84.6%；进一步测定TCID50/0.1mL，观察病毒滴度的变化，结果显示，转染重组慢病毒干扰质粒pLKD-shNP710，pLKD-shM646组其病毒的TCID50/0.1mL分别为10-4.16/0.1mL和10-5.15/0.1mL；应用间接免疫细胞化学方法进一步检测各干扰组及对照组中病毒在细胞中的复制增殖的情况，结果也显示出，转染重组慢病毒干扰质粒pLKD-shNP710，pLKD-shM646组较好的抑制病毒在细胞中复制，重复三次试验均获得一致结果。将重组慢病毒干扰质粒pLKD-shNP710，pLKD-shM646及阴性对照pLKD-control及pLKD-GFP分别与慢病毒包装系统的2个辅助质粒（pR8.2，pVSV-G）共转染293T细胞进行重组慢病毒假病毒的包装，分别于24h、48h收集培养上清，4000r/min离心10min，以去除细胞碎片，然后经0.45μm一次性滤器过滤，4℃50,000g离心2h，以获得浓缩的重组慢病毒，浓缩后的重组慢病毒应用Lastra法测定滴度，滴度为5×107TU/mL。将重组慢病毒分别命名为：LV-NP710、LV-M646、LV-control及LV-GFP。将获得的浓缩的重组慢病毒侵染Vero细胞（培养液中加入终浓度为8μg/mL polybrene，以提高包装的病毒对细胞的侵染能力），经嘌呤霉素抗性筛选，获得具有抗性的细胞，然后将细胞进行传代，传至第20代，并且取第5、10、15、20代的细胞提取基因组，应用PCR和DNA测序方法检测shRNA序列是否整合到细胞基因组DNA中，结果显示，每代细胞基因组DNA中均存在shRNA序列，且在细胞内绿色荧光蛋白呈现较高水平表达，证明成功建立了稳定表达shRNA的细胞系，将其分别命名为：NP710-Vero、M646-Vero、control-Vero及GFP-Vero。将稳定表达shRNA的Vero细胞系感染鹅源新城疫病毒NA-1株（1000个TCID50/0.1mL），应用Real time RT-PCR方法，对病毒感染12h、24h、36h、48h后，各细胞系干扰NDV基因mRNA表达情况进行检测，结果显示，对NP、M基因的抑制率分别为NP710-Vero组（86.8±0.35）%（P＜0.05），M646-Vero组（85.9±0.26）%（P＜0.05）；应用TCID50方法对病毒感染48h后，病毒滴度变化进行检测，结果显示，NP710-Vero细胞组TCID50为10-4.21/0.1mL，M646-Vero细胞组TCID50为10-5.17/0.1mL；应用间接免疫细胞化学方法检测病毒在各组细胞系中复制情况，结果表明，可稳定表达shRNA的细胞系（NP710-Vero组、M646-Vero组）均能明显抑制病毒在细胞中复制增殖。上述结果说明，稳定表达shRNA序列的Vero细胞系建立成功，并且对NDV的复制产生持续的、稳定的抑制作用。本研究进一步将重组慢病毒液（滴度为106TU/mL）注射入新鲜的鹅受精卵胚下腔制备可表达shRNA序列的嵌合体鹅胚，用经灭菌的附带蛋壳膜的合适大小的蛋壳封口，医用胶布固定，然后按标准鹅胚孵化程序进行孵化。提取胚胎基因组DNA，通过PCR鉴定，在检测的鹅胚胎基因组中均有shRNA序列和GFP基因的插入，说明获得的鹅胚为嵌合体胚胎。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第1章 新城疫病毒研究进展
• 1.1 新城疫病毒（NDV）结构
• 1.2 新城疫病毒分类
• 1.3 新城疫病毒的诊断和流行病学
• 第2章 慢病毒载体介导 RNAi 的研究进展
• 2.1 RNA 干扰
• 2.2 慢病毒载体研究进展
• 2.3 慢病毒介导的 RNA 干扰
• 第3章 禽类转基因研究进展
• 3.1 禽类转基因方法学
• 3.2 慢病毒载体介导的转基因研究
• 第二篇 研究内容
• 第1章 鹅源新城疫病毒shRNA设计与重组慢病毒干扰质粒构建
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第2章 鹅源新城疫病毒 NP、M 基因 shRNA 的筛选
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 重组慢病毒假病毒包装及稳定表达 shRNAVero 细胞系的建立
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第4章 胚下腔显微注射表达 shRNA 重组慢病毒假病毒颗粒制备嵌合体鹅胚
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 导师简介
• 作者简介
• 攻读博士期间发表的学术论文及其它成果
• 致谢