论文摘要
背景与目的细胞凋亡是一种由基因控制的自主性有序死亡，对保持组织的健康和正常生长有十分重要意义。细胞凋亡受抑，将导致细胞生存期延长，有利于转化突变的细胞生长积聚，最终可致肿瘤的产生。细胞凋亡受细胞内源性基因、酶类和信号传导途径的调控。目前发现机体内存在两类影响细胞凋亡的基因，即促凋亡基因如Reaper、Smac／DIABLO、HtrA2和抗凋亡基因如Bd-2、P53、CrmA及IAPs。IAPs是近年来发现的具有抗凋亡作用的蛋白分子，其特殊的分子结构及强大的抑制细胞凋亡功能正日益引起人们的关注。IAPs主要通过抑制胱天蛋白酶（caspases）抑制凋亡。目前IAPs家族共发现XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、Livin、Apollon、Survivin、ILP-2八个成员。Livin（KIAP／ML-IAP）于2000年发现，是IAPs家族中的最新成员。人类的Livin基因位于染色体20q13.3，全长46kb，包含7个外显子及6个内含子。Livin在N端含有一个高度保守的长约70个氨基酸的杆状病毒IAP重复序列（baculovirus IAP repeat，BIR），此结构域是结合和抑制胱天蛋白酶的关键部位，也是与Smac相互结合的关键部位；C端含有一个RING环指结构（ring finger），该结构域具有E3泛素连接酶活性，在其促进自身泛素化及Smac泛素化过程中起着关键作用。Livin转录产物因剪接方式不同有两种mRNA亚型Livin a和Livinβ，分别编码298和280个氨基酸的蛋白质。Livin在胚胎组织中存在，在胎儿发育过程中多种组织高表达，可能与生长发育有关，在正常成人的大多数终末组织中（除胎盘）低表达或不表达，而在黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中高表达。目前，国内外对Livin在白血病中的研究多局限于细胞系，而Livin在白血病原代细胞中表达情况鲜有报道。Smac即第2个线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂（second mitochondria-derivedactivator of caspase，Smac），又称DIABLO（direct IAP binding protein with low PL），是一种线粒体促凋亡蛋白，其基因定位于12q24。当细胞发生凋亡时，与细胞色素C一同释放到胞浆中，通过与IAP家族成员相互结合，解除IAP对caspase-9、3、7等的抑制作用，激活caspase级联反应，促进细胞凋亡。Smac在人类睾丸、心、肝、肾等多种组织中表达，在胃癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌等肿瘤细胞中广泛表达。国内有人报道Smac在急性白血病中伴随c-IAPl、c-IAP2、Survivin高表达，但Livin与Smac在急性白血病中的相互关系尚无报道。本研究旨在检测Livin、Smac在急性白血病中的表达及意义以及两者之间的关系。材料与方法：1研究对象为郑州大学第一附属医院2006年1月—12月初发急性白血病（acute leukemia，AL）患者52例，正常对照组为10名骨髓涂片大至正常的非恶性血液病患者（NC），并用HL-60细胞作为阳性对照。2应用RT-PCR方法追踪检测观察52例急性白血病（AL）患者治疗前（新诊断组）、缓解后（缓解组）及复发后（复发组）Livin、Smac mRNA的表达情况。3应用SPSS10.0统计软件进行统计学处理。采用卡方检验（包括Fisher’s精确概率检验）分析Livin、Smac mRNA在急性白血病初治组、缓解组、复发组以及正常对照组中的表达有无差异，分析新诊断组Livin、Smac表达率高低与临床疗效的关系；采用2×2列联表分析Livin、Smac表达水平有无相关性。P＜0.05为差别有统计学意义。结果：1 Livin mRNA在AL细胞中的表达在新诊断的AL患者52例中，Livin的阳性率为40.3％（21／52）；在正常对照组中的表达率为0.0％（10例全部阴性）；新诊断组阳性表达率高于正常对照组（x2=4.437，P=0.035）。在28例缓解组中，Livin mRNA的阳性表达率为0％（0／28），表达率较新诊断组降低，差异具有显著性（x2=15.332，P=-0.000）。复发组的阳性率为50.0％（3／6），较新诊断组高，但无统计学意义（x2=0.000，P=0.988）；较缓解组及正常对照组均明显升高，差别具有显著性（P均小于0.05）。急性髓系白血病（AML）患者组阳性表达率为42.1％，高于急性淋巴细胞白血病（ALL）患者阳性表达率35.7％，但两组间差别无统计学意义（P＞0.05）；两组阳性表达率均高于正常对照组（P值均小于0.05）。2 Smac mRNA在AL细胞中的表达Smac mRNA在新诊断AL组中阳性率为59.6％（31／52），高于正常对照组中的表达率10.0％（1／10），差别具有显著性（x2=6.400，P=-0.011）。在28例缓解组中，Smac mRNA的阳性表达率为14.2％（4／28），低于新诊断组，差异具有显著性（x2=15.196，P=0.000）。复发组的阳性率为60.7％（4／6），较新诊断组高，但无统计学意义（x2=0.000，P=1.000）；较缓解组及正常对照组均明显升高，差别具有显著性（P均小于0.05）。急性髓系白血病（AML）患者组阳性表达率为60.5％，高于急性淋巴细胞白血病（ALL）患者阳性表达率57.1％，但两组间差别无统计学意义（P＞0.05）；两组阳性表达率均高于正常对照组，差异具有显著性（P值均小于0.05）。3 Livin、Smac mRNA表达相关性分析52例患者中Livin和Smac双阳性患者16例（30.8％），双阴性患者16例（30.8％），Livin+／Smac-或Livin-／Smac+患者20例（38.4％）。应用2×2列联表对Livin和Smac mRNA在初治52例AL患者中的表达进行的关联性分析，发现两者的表达具有关联性（x2=4.020，P=0.045）；Pearson列联系数=0.267。4 Livin和Smac mRNA的表达与缓解率的关系44例可进行疗效评估的患者中，Livin mRNA表达阴性者完全缓解率为76.9％（20／28），明显高于表达阳性患者的完全缓解率38.9％（7／18）（x2=4.785，P=0.029）。Smac阴性患者完全缓解率为85.7％（12／14），明显高于表达阳性者完全缓解率50.0％（x2=5.135，P=-0.023）。14例双阴性患者完全缓解率为100％（14／14），明显高于表达双阳性患者的完全缓解率40.0％（6／15）（Fisher’s检验，P=0.017）。结论：1新诊断急性白血病患者Livin mRNA表达明显高于正常对照组，随治疗达完全缓解后其表达水平下降，复发后表达又升高，提示Livin参与急性白血病的发生与发展；Livin mRNA阳性表达的急性白血病患者完全缓解率低于阴性表达的患者，提示Livin高表达是急性白血病不良预后指标。2新诊断急性白血病患者促凋亡蛋白Smac表达水平也明显高正常对照组，治疗缓解后表达下降，复发后表达又升高，变化规律与Livin相同，表达水平与Livin呈正相关。推测在急性白血病发生过程中，Smac以逆转Livin的抑制凋亡作用来实现其促凋亡作用。因此，Livin表达水平增高的同时Smac也相应高表达。