草莓pgip基因的克隆及其序列分析

论文摘要

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting proteins,PGIPs）是内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）的抑制剂,当病原真菌侵染植物时,它能与病原真菌分泌的endo-PG专一性结合,一方面延缓病原真菌对植物细胞壁的降解,另一方面间接地影响病原真菌的生长繁殖速度,在抵御真菌病害方面发挥重要作用,同时引发植物的防卫反应。它还与大多数植物抗性基因一样,属于富亮氨酸重复（Leucine-richrepeat,LRR）蛋白超家族。pgip基因在植物抗病育种中已成为一重要的候选基因,其分离鉴定是进行转pgip基因研究的基础。根据蔷薇科植物pgip基因序列保守区域设计两对特异引物,以草莓（Fragaria×ananassa Duch）叶片制备的总DNA和总RNA为模板,采用PCR技术,克隆到了约1,300bp和1,000 bp的DNA和cDNA片段。这两条片段与pMD 18-T载体连接后转化E.coli JM109,对筛选到的阳性克隆进行序列测定与分析结果表明,获得的DNA片段长1,389bp,含一个长度为168bp的内含子,cDNA长1,053 bp。BLAST比对结果表明,克隆到的片段是草莓的pgip基因,命名为Fapgip,GenBank登录号为EU117215和EU117213。该片段含一个长度为999bp的完整开放阅读框,编码332个氨基酸残基组成的蛋白质,具有5个潜在的N-糖基化位点,中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。预测该蛋白质分子量为37.1 kDa,等电点为7.67,N端24个氨基酸残基构成的疏水区域为信号肽。序列同源比对结果显示,所克隆的Fapgip基因与蔷薇科其它植物pgip基因核苷酸序列的同源性为75.2～86.5%,推导氨基酸序列的同源性为72.9～87.8%;同源树表明其明显区别于其它pgip基因;进一步的系统进化树分析表明,所克隆的Fapgip（EU117213）除与树莓的pgip（AJ620336）关系较近外,与寿星桃（AY903219）、美洲李（AY883417）和梅（AY903223）等的pgip基因都存在较远的进化关系。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩写词
• 1. 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIPs）研究进展
• 1.2.1 PGIPs的发现及其在植物中存在的广泛性
• 1.2.2 PGIPs的生物学功能及作用机理
• 1.2.3 pgip基因的特点
• 1.2.4 pgip基因的表达与调控
• 1.2.5 pgip基因在植物抗病育种中的应用
• 2. 本研究的目的和意义
• 3. 材料和方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株
• 3.1.3 载体
• 3.1.4 试剂与试剂盒
• 3.1.5 培养基
• 3.1.6 溶液和缓冲液
• 3.2 主要仪器设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 技术路线
• 3.3.2 草莓叶片总DNA和总RNA的提取
• 3.3.3 引物的设计与合成
• 3.3.4 电泳技术
• 3.3.5 DNA/RNA OD值的测定
• 3.3.6 反转录
• 3.3.7 PCR
• 3.3.9 DNA片段的回收
• 3.3.10 DNA片段和载体DNA的连接
• 3.3.11 大肠杆菌的转化
• 3.3.12 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 3.3.13 DNA序列测定和分析
• 4. 结果与分析
• 4.1 DNA和RNA的提取与检测
• 4.2 PCR及RT-PCR扩增结果
• 4.3 阳性克隆的筛选和鉴定
• 4.4 草莓基因组DNA的PGIP片段序列测定与分析
• 4.5 草莓cDNA的PGIP片段序列分析及其结构特征
• 4.5.1 Fapgip的cDNA序列及其推导氨基酸序列分析
• 4.5.2 草莓PGIP氨基酸组成及密码子偏爱性
• 4.5.3 Fapgip cDNA序列及其编码氨基酸序列同源性分析
• 4.5.4 进化树分析
• 4.5.5 草莓PGIP信号肽预测
• 4.5.6 FaPGIP蛋白质亲水性和疏水性分析
• 5. 讨论
• 5.1 DNA的提取及检测
• 5.2 RNA的提取及检测
• 5.3 cDNA片段的密码子偏爱性分析
• 5.4 pgip基因同源性及进化关系的分析
• 6. 小结
• 参考文献
• 致谢