黄芪抑制小鼠胸腺淋巴细胞凋亡与促进增殖的作用

论文摘要

临床上,免疫功能低下或因使用西药免疫抑制剂治疗导致细胞免疫和体液免疫都受到抑制,严重影响了人们的生活水平和生活质量。而免疫功能低下或免疫功能抑制和细胞凋亡有着极为密切的关系。细胞增殖却参与了组织结构和功能的恢复,促进机体康复,提高机体的免疫力,增强抗病能力。胸腺做为机体的中枢免疫器官,是各种T细胞分化成熟的场所;其功能状态的正常与否,直接关系到到机体整体免疫情况的好坏。因此,检测胸腺淋巴细胞的凋亡与增殖情况是从客观上判断机体整体免疫功能好坏的一个重要手段,尤其是在筛选评价某些药物在机体免疫调节方面。本研究选择地塞米松（Dex）诱导小鼠胸腺萎缩模型及小鼠胸腺淋巴细胞凋亡模型为研究对象,通过观察具有肯定免疫药理作用的补气健脾代表方黄芪注射液AI对Dex诱导小鼠胸腺萎缩模型及小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的作用研究,以期探讨黄芪注射液治疗免疫抑制剂所致T淋巴细胞免疫功能低下疾病的免疫药理作用及发生的机制。第一章黄芪注射液对Dex诱导的小鼠胸腺萎缩的干预作用研究1目的建立Dex诱导的小鼠胸腺萎缩模型,并观察黄芪注射液治疗2天和5天后各组小鼠胸腺指数,胸腺病理学改变,胸腺皮髓质比例,来探讨黄芪注射液抗Dex诱导的小鼠胸腺萎缩的作用。2方法72只4-6周龄SPF级昆明小鼠,雌雄各半,体重18～22g,随机均分为对照组,模型组(地塞米松50mg.kg-1体重),IL-2组(5IU.kg-1体重),黄芪高(2g.kg-1体重)、中(1g.kg-1体重)、低(0.5g.kg-1体重)三个剂量组共六组,每组12只,除对照组外,各组小鼠均腹腔注射地塞米松,1次/天,连续2天,对照组腹腔注射等容量注射用生理盐水。于造模同时IL-2组注射IL-2;黄芪高、中、低剂量组分别腹腔注射高、中、低剂量的黄芪注射液;对照组腹腔注射等量生理盐水。于给药第2天和第5天,每组随机选取一半小鼠,称体重后脱臼处死小鼠,取出胸腺并称重,计算胸腺指数,将胸腺固定在10%的甲醛溶液中,HE染色观察胸腺HE病理形态学改变;每张切片随机选取5个视野,Image-pro PLUS 5.1图像分析系统分析皮质与髓质的比例,以5个视野平均值作为该样本的测量值。实验数据采用进行单因素方差分析统计处理。3结果（1）黄芪注射液对小鼠胸腺指数的影响治疗2天后,对照组小鼠胸腺指数为5.01±1.13、模型组1.17±0.26、IL-2组1.68±0.52、黄芪高剂量组1.68±0.44、黄芪中剂量组1.49±0.29、黄芪低剂量组1.74±0.69,与模型组比较,黄芪高、低剂量组和IL-2组胸腺指数有显著性升高（P＜0.05）。治疗5天后,对照组小鼠胸腺指数为5.66±0.38、模型组1.32±0.26、IL-2组1.70±0.57、黄芪高剂量组1.42±0.31、黄芪中剂量组1.40±0.33、黄芪低剂量组2.04±0.43,与模型组比较,黄芪低剂量组小鼠胸腺指数有显著性升高（有P＜0.05）。（2）黄芪注射液对小鼠胸腺病理形态学及皮质与髓质的比例的影响镜下观察,治疗2天后,黄芪各治疗组及IL-2组治疗2天后皮质变薄均有所好转,髓质细胞略有增多。与对照组相比,模型组胸腺皮髓质的比例显著降低（P＜0.01）,与模型组相比,黄芪低剂量组皮髓质比例显著升高（P＜0.05）。镜下观察,治疗5天后,黄芪注射液各治疗组均见皮髓质变薄程度和皮质胸腺细胸减少程度较模型组轻,与模型组相比,黄芪高、低剂量组和IL-2组胸腺皮髓质的比例均有显著性升高（P＜0.05）。4结论（1）Dex可诱导小鼠胸腺萎缩,导致小鼠胸腺淋巴细胞凋亡。（2）黄芪注射液能够提高小鼠胸腺指数,逆转胸腺皮髓质比例,改善胸腺病理形态,故黄芪注射液有保护Dex诱导的小鼠胸腺萎缩的作用。第二章黄芪注射液对Dex诱导的小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的抑制作用1目的通过观察黄芪注射液对Dex诱导的小鼠胸腺淋巴细胞凋亡模型的小鼠治疗2天和5天后的胸腺凋亡细胞面积百分比,小鼠胸腺淋巴细胞Caspase-3、Bcl-2的表达及阳性细胞面积百分比、24小时胸腺淋巴细胞存活率、24小时胸腺淋巴细胞凋亡率,来探讨黄芪注射液对Dex诱导的小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的抑制作用及机制研究。2方法（1）动物分组及造模与给药造模与分组同第一章方法。石腊切片,TUNEL法观察淋巴细胞凋亡;免疫组织化学染色观察Caspase-3与Bcl-2表达;每张切片随机选取5个视野,Image-pro PLUS 5.1图像分析系统分析淋巴细胞凋亡、Caspase-3与Bcl-2表达,以5个视野平均值作为该样本的测量值。（2）MTT法测胸腺淋巴细胞24小时存活率分离胸腺淋巴细胞,将胸腺淋巴细胞以5×105/孔的密度接种至96孔板上。设六个组,分别为SO+Dex组,S1+Dex组,S2+Dex组,S3+Dex组,IL-2+Dex组,模型组。黄芪注射液各浓度依次为SO(200mg.ml-1);S1(20mg.ml-1);S2(2mg.ml-1);S3(0.2mg.ml-1)。每孔加100μl细胞,药物100μl,（Dex终浓度为10μM）。在37℃5%的CO2培养箱中培养24小时。MTT法测存活率。（3）流式细胞仪检测胸腺淋巴细胞24小时凋亡率分离胸腺淋巴细胞,将胸腺淋巴细胞以5×105/孔的密度接种至96孔板上。设五个组,分别为S3组,S4组,S5组,模型组,对照组。黄芪各组浓度为S3:0.2mg.m1-1;S4:0.1mg.ml-1;S5:0.05mg.ml-1;模型组,对照组。每孔加100μl细胞,药物100μl,（Dex终浓度为10μM）。在37℃5%的CO2培养箱中培养24小时。细胞固定处理,PI单染后,样本送中山医一附院免疫检测中心检测。3.结果（1）黄芪注射液对小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的的抑制作用治疗2天后,光镜下:黄芪高、中、低剂量组的凋亡细胞比模型组减少。凋亡细胞面积百分比为:对照组0.20%±0.21%、模型组3.86%±1.42%、黄芪高剂量组2.81%±0.81%、黄芪中剂量组3.01%±0.97%、黄芪低剂量组2.33%±1.09%。与模型组比,黄芪低剂量组凋亡细胞面积百分比显著性降低（P＜0.05）治疗5天后,光镜下:黄芪高剂量、中、低剂量组的凋亡细胞比模型组明显减少。各组小鼠胸腺淋巴细胞凋亡面积百分比,为对照组为0.20%±0.08%,模型组6.40%±3.78%,黄芪高剂量1.80%±1.29%,黄芪中剂量2.21%±0.75%,黄芪低剂量0.50%±0.27%,黄芪高、中、低剂量组与模型组比,凋亡细胞明显减少,（P＜0.05或P＜0.01）。（2）黄芪注射液对凋亡相关基因Caspase-3和Bcl-2的影响1)治疗2天后凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2表达①Caspase-3镜下观察对照组和黄芪注射液各剂量组Caspase-3阳性表达少见。与模型组相比,黄芪低剂量组Caspase-3表达阳性面积百分比有显著降低（P＜0.05）。②Bcl-2镜下观察光镜下观察,黄芪各治疗组Bcl-2表达均比模型组增多。与模型组相比,黄芪低剂量Bcl-2阳性细胞面积百分比有显著性升高（P＜0.05）。2)治疗5天后凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2表达①Caspase-3镜下观察实验2天后,各治疗组小鼠胸腺Caspase-3表达未见明显减少。与模型组相比,黄芪各剂量组和IL-2均无显著性差别（P＞0.05）。②Bcl-2镜下观察实验5天后,与模型组相比,黄芪高、低剂量组小鼠胸腺淋巴细胞中Bcl-2阳性细胞面积百分比均有显著性升高（P＜0.01）。（3）黄芪注射液对小鼠胸腺淋巴细胞24小时存活率的影响MTT检测结果显示,24小时淋巴细胞存活率为:SO+Dex组39.84%±4.41%、S1+Dex组46.42%±10.90%、S2+Dex组47.88%±8.98%、S3+Dex组58.18%±4.90%、IL-2组46.17%±2.87%、模型组47.96%±6.38%,与模型组相比,S3+Dex组(0.2mg ml-1)小鼠淋巴细胞的凋亡率有显著性降低（P＜0.05）。（4）黄芪注射液对小鼠胸腺淋巴细胞24小时凋亡率的影响流式细胞仪检测结果显示,各组细胞凋亡率为:S3+Dex组84.57%±5.33%、S4+Dex 78.67%±0.95%、S5+Dex组81.37%±2.10%、模型组77.97%±1.75%、对照组54.63%±3.09%。与模型组比,对照组小鼠胸腺淋巴细胞凋亡率有显著升高（P＜0.05）;黄芪各浓度组小鼠胸腺淋巴细胞凋亡率与模型组相比无统计学意义（P＞0.05）。4结论（1）黄芪注射液可以抑制Dex诱导的小鼠胸腺淋巴细胞凋亡。（2）黄芪注射液可以上调Bcl-2表达和下调Caspase-3的表达。（3）黄芪注射液可提高Dex诱导的小鼠胸腺淋巴细胞凋亡后淋巴细胞24小时存活率。第三章黄芪注射液促进小鼠胸腺淋巴细胞增殖的作用及机制研究1目的通过观察黄芪注射液及其含药血清对小鼠胸腺淋巴细胞PCNA的表达、小鼠血清和胸腺IL-2的含量、淋巴细胞体外48小时凋亡率、淋巴细胞体外24小时细胞存活率的影响,探讨黄芪注射液对小鼠胸腺淋巴细胞增殖的影响及其机制。2方法（1）动物造模、分组与给药动物造模、分组与给药同第一章方法。动物末次给药后2小时,摘眼球取血、分离血清;小鼠脱臼处死,取胸腺,剪为两块,一块置于盛有1ml蛋白裂解液的玻璃匀浆器中冰盒中,匀浆2min,取1.5ml匀浆于离心管中,4℃12000转/min,离心10min,取上清,Western-Blot及免疫组织化学染色测PCNA蛋白的表达,ELISA检测小鼠血清和胸腺匀浆中IL-2的含量;另一块置于10%甲醛溶液中,常规石蜡包埋、切片,免疫组织化学染色,观察PCNA表达。（2）黄芪注射液对正常小鼠胸腺淋巴细胞24小时存活率的影响分离胸腺淋巴细胞,细胞计数后,以5×105/孔的密度接种至96孔板上。设六个组,分别为黄芪注射液各组:S0组,S1组,S2组,S3组和IL-2组,C组。S0(200mg.ml-1)、S1(20mg.ml-1)、S2(2mg.ml-1)、S3(0.2mg ml-1);C组为对照组。每组设3个复孔,每孔加不同浓度黄芪注射液注射液100μl。MTT检测存活率。步骤同第二章方法（2）。（3）黄芪注射液对正常小鼠胸腺淋巴细胞体外培养48小时凋亡率的影响将淋巴细胞以5×105/孔的密度接种至96孔板上。设四个组,分别为S3组,S4组,S5组,对照组。黄芪为三个浓度分别为S3:0.2mg.ml-1;S4:0.01mg.ml-1;S5:0.05mg.ml-1;每个浓度设3个复孔。每孔加100μl细胞,黄芪注射液注射液100μl。在37℃的5%CO2培养箱中培养48小时。流式细胞仪检测细胞增殖。（4）黄芪含药血清及胸腺匀浆上清液对淋巴细胞24小时存活率的影响1)21只5周龄22g SPF级KM小鼠随均机分为三组:造模同第一章方法。用药5天后,将小鼠脱臼处死,摘眼球取血,制备含药血清,同时制备胸腺组织匀浆上清液,—20℃冰箱保存,备用。ELISA法检测IL-2含量。2)2.5%及5%的血清及胸腺匀浆上清分别作用于3个细胞复孔24小时。MTT法测小鼠胸腺淋巴细胞存活率。（5）黄芪注射液作用24小时后正常小鼠胸腺淋巴细胞IL-2含量的变化将淋巴细胞以5×105/孔的密度接种至96孔板上。设3个组,分别为S2,S3,C组。S2:黄芪注射液稀释100倍;S3:黄芪注射液稀释1000倍（同前）;C组:对照组。每组设3个复孔,每孔加100μl细胞,黄芪注射液100μl。在37℃的CO2培养箱中培养24小时。ELISA法检测IL-2含量。3.结果（1）黄芪注射液对小鼠胸腺PCNA表达的影响实验2天后,黄芪高剂量组、低剂量组及IL-2组PCNA表达比模型组增多。各组淋巴细胞PCNA百分比:为对照组1.79%±0.42%、模型组3.49%±0.11%、IL-2组3.04%±1.29%、黄芪高剂量组3.69%±2.82%、黄芪中剂量组3.79%±1.53%、黄芪低剂量组6.90%±4.18%,与模型组比较,黄芪注射液各剂量组淋巴细胞PCNA百分比无显著性差异（P＞0.05）。实验5天后,黄芪注射液高中、低剂量组及IL-2组PCNA表达均较多,尤其是低剂量组可见大量PCNA表达比模型组、对照组增多。PCNA阳性细胞百分比分别为对照组5.2%±3.9%、模型组7.9%±3.4%、白介素14.5%±6.8%、黄芪高剂量16.2%±7.1%、黄芪中剂量16.0%±7.1%、黄芪低剂量27.9%±4.5%,与模型组比较,黄芪高、中、低剂量组和IL-2组PCNA阳性细胞百分比均有显著性升高（P＜0.05或P＜0.01）。（2）治疗5天后Western-blot免疫印迹显示:PCNA蛋白含量从高到低为:黄芪低剂量组→黄芪高剂量组→对照组→模型组→IL-2组→黄芪中剂量组。（3）黄芪注射液作用5天后小鼠血清中和胸腺匀浆上清中IL-2的含量血清中IL-2含量结果显示:对照组20.72±6.48（pg/ml）、模型组21.74±3.55（pg/ml）、黄芪高剂量组20.12±8.04（pg/ml）、黄芪中剂量组20.93±7.61（pg/ml）、黄芪低剂量组47.27±15.01（pg/ml）。与模型组比较,黄芪注射液低剂量组血清中IL-含量有显著性升高（P＜0.05）。胸腺匀浆上清液中IL-2含量结果显示:对照组135.75±11.15（pg/ml）、模型组82.93±11.56（pg/ml）、黄芪高剂量组192.24±12.13（pg/ml）、黄芪中剂量组170.32±36.62（pg/ml）、黄芪低剂量组211.84±12.28（pg/ml）。与模型组比,各治疗组胸腺中IL-2含量均有显著性升高（P＜0.01）。（4）黄芪注射液对小鼠胸腺淋巴细胞24小时存活率的影响（MTT法）与对照组比较,黄芪注射液浓度为0.2mg ml-1时淋巴细胞24小时存活率有显著性差异（P＜0.05）,黄芪注射液浓度为200mg ml-1时细胞存活率显著降低（P＜0.01）。（5）黄芪注射液对小鼠胸腺淋巴细胞48小时凋亡率的影响（FCM法）黄芪各浓度组48小时凋亡率分别为:对照组:82.03%±0.37%;S3:83.51%±1.32%;S4:81.63%±1.42%;S5:82.73%±1.85%;与对照组比较,黄芪各浓度组淋巴细胞48小时凋亡率均无显著性差异（P＞0.05）。（6）黄芪注射液作用24小时后小鼠胸腺淋巴细胞中IL-2的含量（ELISA法）与对照组相比,黄芪浓度为S2:组2mg.ml-1及S3组0.2mg.ml-1时小鼠胸腺淋巴细胞24小时后,培养上清中IL-2的含量有显著性升高（P＜0.05或P＜0.01）。4结论（1）黄芪注射液可使小鼠胸腺淋巴细胞PCNA表达增多。（2）黄芪注射液可促进小鼠血清和胸腺淋巴细胞分泌IL-2。（3）黄芪注射液可提高小鼠胸腺淋巴细胞24小时存活率。5最后对全文进行归纳总结:（1）黄芪注射液可抑制糖皮质激素Dex诱导的小鼠胸腺萎缩,提示黄芪注射液可用于免疫功能低下或免疫缺陷性疾病的治疗;（2）黄芪注射液体内抑制胸腺萎缩机制可能与:①上调Bcl-2表达、下调Caspase-3表达、抑制淋巴细胞凋亡,②通过促进PCNA表达、提高血清及胸腺组织中IL-2含量,促进胸腺淋巴细胞增殖有;（3）黄芪注射液可提高体外小鼠胸腺淋巴细胞存活率,可能与其促进IL-2合成与释放,进而促进胸腺淋巴细胞自身增殖及抑制凋亡有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 文献研究
• 第一章 细胞增殖与凋亡的研究进展
• 1.细胞增殖与凋亡
• 1.1 凋亡细胞的主要特征
• 1.2 细胞凋亡和细胞坏死的区别
• 1.3 细胞凋亡与程序性细胞死亡（PCD）
• 2 细胞增殖与凋亡的机理
• 2.1 细胞增殖调控机制
• 2.1.1 p16-cyclinD-Rb
• 2.1.2 PCNA
• 2.1.3 p53家族
• 2.1.3.1 p53
• 2.1.3.2 p73
• 2.1.4 Myc基因家族
• 2.2 凋亡调控机制
• 第二章 黄芪的药理作用研究进展
• 1.凋亡与增殖调节作用
• 1.1 细胞凋亡作用
• 1.2 免疫细胞增殖作用
• 1.3 其它免疫调节作用
• 2 对心血管系统的作用
• 2.1 对心脏的作用
• 2.2 对血管、血压的影响
• 3 对应激反应的影响
• 3.1 抗疲劳作用
• 3.2 耐低温、高温作用
• 4 抗辐射作用
• 5 抗衰老作用
• 6 对泌尿系统的作用
• 7 保肝作用
• 8 对中枢神经系统的作用
• 9 对平滑肌的作用
• 10 激素样作用
• 11 抗菌、抗病毒、抗肿瘤作用
• 第二部分 实验研究
• 第一章 黄芪注射液对DEX诱导的小鼠胸腺萎缩的干预作用研究
• 1 材料
• 2.方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 第二章 黄芪注射液对DEX诱导的小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的抑制作用及机制研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 黄芪注射液促进小鼠胸腺淋巴细胞增殖的作用及机制研究
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 总结与展望
• 参考文献
• 附Ⅰ 本论文中使用的缩略语（按英语首字母排列）
• 附Ⅱ 黄芪、入药部位及其成药制剂
• 在学期间发表论文情况
• 致谢