RAGE和SLP76相互作用的研究

论文摘要

晚期糖基化终末产物（AGE）是蛋白质、脂质和核酸等生物大分子在氧化环境里的一种还原糖共价加成物。特别在生物大分子循环代谢速率减慢（如衰老）和一些易造成氧化应激的疾病（如糖尿病、动脉粥样硬化等）过程中生成增多。生物大分子一旦被还原糖共价修饰形成AGE，就具有了高度交联性、不可逆转性和荧光性。AGE若发挥其起病理作用必须通过其特异性受体。最近发现了一种新的与AGE相互作用的受体—晚期糖基化终末产物受体（RAGE），研究证实其与AGE结合后可激活细胞内多条信号转导通路，进而发挥其病理功能。RAGE属于免疫球蛋白超家族的成员，其由404个氨基酸残基组成，分子量约为42.8 kDa，其结构包括信号肽、细胞外段、跨膜段和细胞内段四个部分。RAGE在体内的分布具有组织特异性，主要分布于外周血单核-巨噬细胞系统、血管内皮、肺脏和脑，在子宫肌层和关节滑膜中也有表达。RAGE是一种多配体识别受体，其配体除AGE外，还有两性蛋白、淀粉样β肽（Aβ）和S100／钙粒蛋白。目前认为RAGE不是识别特定的氨基酸序列，而是识别其配体结构中所特有的结构—β-片层或原纤维。因此有人提出：RAGE可能和Toll样受体（TLR）家族成员一样属于模式识别受体（PRR）。RAGE与不同的配体结合可以激活细胞内不同的信号转导通路，如RAGE与两性蛋白相互作用可通过Rac和Cdc42通路介导神经元轴突的生长；AGE和Aβ与RAGE相互作用可通过Ras通路介导细胞氧化应激和核因子κB（NF-κB）的活化进而介导细胞损伤。进一步的研究表明RAGE与不同配体的结合在不同疾病的病理过程中起到关键性的作用。如RAGE与AGE的结合在糖尿病慢性并发征的发生发展中致关重要；RAGE与Aβ的相互作用在阿尔茨海默氏病（AD）的病理过程中起到关键作用；在AD的病人脑中RAGE的表达上调，这说明RAGE与神经元功能异常和死亡相关；RAGE与两性蛋白的相互作用不仅可以促进神经元轴突的生长，而且还可以介导肿瘤细胞的生长和迁移。RAGE可以激活细胞内多条细胞信号转导通路，又与糖尿病慢性并发征、肿瘤和阿尔茨海默氏病等多种疾病有关，因此它已成为国际上研究的热点。我们实验室侧重细胞信号转导方面的研究，因此我们十分关心RAGE所介导的下游细胞信号转导通路。实验室早期的工作是运用T7噬菌体展示技术从人肺的cDNA文库中筛选得到与RAGE胞内段作用的蛋白12种，其中有9种为目前已知的编码序列。我们认为这9种蛋白质中，名为含有SH2结构域的76 kDa的白细胞蛋白（SLP76）的蛋白质是与RAGE胞内段相互作用的候选分子。这是由SLP76的性质和特点所决定的。SLP76蛋白质分子由533个氨基酸残基组成，分子量约为64 kDa。其结构包括氨基末端的SAM结构域、羧基末端的SH2结构域和位于二者之间的富含脯氨酸的结构域及多个磷酸化位点。SLP76是血源性细胞所特有的一种接头蛋白，其在T细胞受体相关信号通路及凝血功能方面起到重要作用。在细胞中SLP76可以和多种蛋白相互作用，其中包括蛋白激酶类，如70 kDa的T细胞受体Zeta链相关蛋白激酶（ZAP70）、蛋白酪氨酸激酶4（PTK4）等；磷酸酶类，如包含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1（SHP1）等；接头蛋白类，如生长因子受体结合蛋白2（Grb2）、CLB等。SLP76在细胞中可以和这么多的蛋白质分子相互作用，说明其可以参与到多条信号转导通路中。目前研究得较为明确的有两条：第一，细胞表面的配体与受体相互作用后，可以使SLP76氨基末端的酪氨酸磷酸化，磷酸化的酪氨酸基团可以和鸟苷酸转换因子Vav的SH2结构域相结合，进而活化JNK激酶；第二，SLP76含有富含脯氨酸的结构域，其可以与另一种接头蛋白Grb2的SH3结构域结合，形成由多种接头蛋白组成的复合物，将细胞外的信号传递给Ras，后者进一步活化丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MKKK）的一种—Raf，其可以磷酸化细胞外信号调控激酶（ERK），最终导致氧化应激和NF-κB等转录因子的活化。我们推测经T7噬菌体展示技术筛选出来的与RAGE胞内段相互作用的蛋白质中，SLP76是与RAGE胞内段相互作用的候选分子，原因有三：第一，在体内有RAGE和SLP76共同的表达细胞，如外周血单核-巨噬细胞；第二，SLP76参与介导受体下游的信号转导有先例，如T细胞受体（TCR）信号转导通路、Fc-gammaR-I信号转导通路等；第三，RAGE参与的信号通路与SLP76参与的信号通路有重叠，如Ras环节的参与，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）如JNK、ERK的活化，以及转录因子如NF-κB等的活化。因此我们可以提出如下假设：当RAGE与其配体相互作用后，RAGE胞内段通过直接或间接的方式与由SLP76参与构成的接头蛋白复合体相互作用，再由复合体中的Grb2将信号传递给Ras，Ras可以激活下游的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶Raf，信号由高度保守的三级激酶模式（MKKK／MKK／MAPK）向下游传递，进而触动细胞内的氧化应激并导致NF-κB的活化，使得效应细胞细胞因子表达谱发生变化，产生相应的生理学和病理学功能。如果上述假设能够得到证实，对阐明RAGE和SLP76相互作用在细胞信号转导过程中的作用具有重要意义，并且能够以RAGE和SLP76相互作用为切入点揭示RAGE相关疾病的发病机制。为此我们对RAGE和SLP76的相互作用和RAGE和SLP76相互作用介导的功能进行了初步研究。实验分三个阶段进行：第一阶段即准备阶段，构建实验所需的质粒和制备刺激物—AGE。从人肺的cDNA文库中成功钓取人RAGE和SLP76的全长序列；并将RAGE的胞内段（RAGE／C）序列亚克隆入pGEX-KG载体中，将SLP76全长序列亚克隆入pET-14b载体中，二者用于体外结合实验；成功构建了带EGFP标签的RAGE胞内段、带HA标签的RAGE和带Flag标签的SLP76真核表达载体，用于体内结合实验；制备完成具有功能的AGE。第二阶段，体外结合实验。纯化得到带GST标记的RAGE胞内段蛋白和带His标记的SLP76蛋白用于体外结合实验，结果发现GST-RAGE／C和His-SLP76在体外可以特异性地结合，且相互作用较GST对照组强。第三阶段，体内结合实验。本阶段分两步进行，首先将质粒pEGFP-C2-RAGE＼C和pcDNA3-Flag-SLP76共转染HEK293细胞，并设立不转染和单转染组作为对照，结果发现RAGE胞内段和SLP76在细胞内没有相互作用，这可能是由于细胞内RAGE和SLP76的相互作用是刺激依赖性的，必须在RAGE与其配体相作用后才发生，或有赖于RAGE蛋白的正确定位；第二步首先是将质粒pcDNA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共转染HEK293细胞，同时设立50μg／ml AGE刺激0 min、1 min、2 min、5 min、10 min、15 min和30 min组，进行体内结合实验，以寻找AGE刺激后SLP76与RAGE相互作用的时间。结果发现细胞转染后撤血清24小时，并以浓度为50μg／ml的AGE刺激15 min的条件下，SLP76与RAGE有特异性结合。这说明SLP76与RAGE的相互作用是发生在AGE刺激后15 min的时间点上。然后，将质粒pcDNA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76共转染HEK293细胞，同时设立不转染组和单转染组作为对照，并引入AGE刺激和HAS对照刺激15 min，进行体内结合实验，结果发现只有共转染50μg／ml AGE刺激15 min组SLP76与RAGE有特异性结合。综上所述，我们成功构建了质粒pET-14b-SLP76、pEGFP-C2-RAGE＼C、pcDNA3-HA-RAGE和pcDNA3-Flag-SLP76。纯化得到GST-RAGE和His-SLP76两种蛋白。成功制备AGE。RAGE与SLP76的体内、体外结合实验均证实RAGE和SLP76之间存在相互作用。同时我们证实这种相互作用存在刺激依赖性，并且RAGE和SLP76在50μg／ml AGE刺激15 min后的相互作用最为明显。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 试剂配制
• 2.1.3 质粒、菌株和细胞株
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 质粒的构建
• 2.2.2 蛋白纯化
• 2.2.3 体外结合实验
• 2.2.4 AGE制备
• 2.2.5 细胞培养与转染
• 2.2.6 HA-RAGE和Flag-SLP76在HEK293细胞的表达
• 2.2.7 免疫共沉淀实验
• 第三章 结果
• 3.1 质粒的构建
• 3.2 蛋白纯化
• 3.3 GST-RAGE/C和His-SLP76的体外结合实验
• 3.4 EGFP-RAGE/C和Flag-SLP76的免疫共沉淀实验
• 3.5 HA-RAGE和Flag-SLP76的免疫共沉淀实验
• 第四章 讨论
• 第五章 小结
• 参考文献
• 附录
• 附录1（英文缩略词表）
• 附录2（综述）
• 发表文章
• 致谢