黄义鸿朱伟民王大平
（广东省深圳市第二人民医院风湿免疫科广东深圳518035）
【摘要】目的:从遗传毒理学方面了解并评价磁性纳米多孔复合（Nano-HA/PLLA/Fe2O3）材料的生物相容性，从而为其在移植肌腱固定的临床运用提供依据。方法:用Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料制备混悬液，进行Ames致突变试验，以检测其对鼠伤寒沙门菌的致突变比值（实验组回变菌落数/阴性对照组回变菌落数）。结果:此人工骨材料的各浓度组混悬液对鼠伤寒沙门菌的致突变比值均小于2。结论:Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料不引起鼠伤寒沙门菌的回复突变数增加，说明此材料无致基因突变性。
【关键词】羟基磷灰石纳米界面固定材料致突变试验
【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2014）11-0061-02
Mutagenicitytestofmagneticcompositesmaterialforinterfacefixation
Huangjianghong,Zhuweimin,Wangdaping,etal.Departmentofrheumatism，ShenzhenSecondPeople’sHospital,Shenzhen,518035
【Abstract】ObjectiveToevaluatethebio-compatibilityandsafetyofthemagneticcomposite（Nano-HA/PLLA/Fe2O3）fromtheaspectsofinheritedtoxicologyofitfortheclinicaluseofinterfacefixation.MethodsProduceNano-HA/PLLA/Fe2O3magneticcompositesmaterialandit’sdiffusionandtestthediffusionthroughAmestest。Theobservationmarkersofthetestarethemutagenesratesofmurinetyphoidsalmonella(MR).ResultsThemutagenesisratesofmurinetyphoidsalinemonellaintheexperimentalgroupsofalldosageleversarelessthan2.ConclusionThemagneticcompositesmaterialwillnotcausetheincreaseofthebackmutationinmurinetyphoidsalmonellawhichshowthatthisartificialbonewillnotcausegenemutation.
【Keywords】hydroxyapatitenanometerinterfacefixationmutagenicitytest
界面螺钉是关节镜下前交叉韧带重建中常用的肌腱固定物，但存在着力学强度差、异物反应、降解速度与骨道愈合不匹配和无骨诱导活性等缺点，导致腱-骨、材料-骨质生物界面愈合不良，成为术后骨道扩大、韧带松弛的重要原因[1]。本研究通过低温快速成型仪将Nano-HA、PLLA、Fe2O3这三种材料复合制备得到磁性纳米多孔复合（Nano-HA/PLLA/Fe2O3）支架材料[3]，并参照国内外对生物材料评价方面的有关标准[3，4]，拟通过Ames试验从遗传毒理性方面来评价此Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料的生物相容性，从而为其运用于前交叉韧带重建术中移植肌腱界面固定的临床应用提供安全性依据。
1材料和方法
1.1材料制备
本实验所用的Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料由深圳市第二人民医院组织工程重点实验室与中国科学院深圳先进技术研究院联合研制，立方体（25mm×25mm×25mm），见图1。Nano-HA/PLLA/Fe2O3材料先用紫外线照射半小时，经PBS液浸泡、清洗，75%乙醇侵泡消毒后干燥备用。
图1Nano-HA/PLLA/Fe2O3材料
1.2实验方法
取Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料，按重量比以2.5%羟甲基纤维素钠溶液配成5mg/ml，0.5mg/ml及0.01mg/ml三种不同浓度的混悬液受试。菌种采用由美国Ames实验室提供并由湖南省疾病控制中心繁殖保存的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型菌株（TA-97、TA-98、TA-100和TA-102），经性状鉴定合格后进行实验。由于Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料是用于人体内植入的，植入人体后肝细胞微粒体酶系（S9）就有可能诱变HA(假如HA有诱变作用)，而细胞体内无此酶，为了使实验条件更接近体内环境，将培养板分为活化实验组（加S9溶液）和非活化实验组（不加S9溶液）。大鼠肝脏微粒体酶系(S9)由多氨联苯诱导，制成肝匀浆后-80℃冰箱内保存，使用时用2-氨基芴测定其活力。实验用柔毛霉素（浓度为25ug/0.1ml）作为菌株培养时的直接致突变活性指示(不加S9)，2-氨基芴（50ug/0.1ml）作为菌株的间接致突变活性指示(加S9)；以叠氮化钠(5ug/0.1ml)作为阳性对照，以同样体积生理盐水作为阴性对照。每个菌种的各个剂量组均各设3个平行皿。
通过平板渗入法将不同浓度组混悬液与菌株在最低营养板上混合培养，经37℃培养48小时后，分别进行观察回变菌落数结果。每组取其3个平行培养皿的平均回变菌落数，依据出现的致突变比值（如下式计算）检测nano-HA材料制品中是否存在诱变物质。
致突变比值（MR）=实验组回变菌落数（Rt）/阴性对照组回变菌落数（Rc）
2结果
四个菌株在各个受试浓度待测液在加S9与不加S9的情况下，致突变比值即回变菌株数与对照组回变菌株数的比值（Rt/Rc）均小于2.0，而阳性对照组致突变比值则均大于2（见表1），据此可以认为Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料在Ames试验中无致突变性。
表1nano-HA人工骨Ames试验结果
注：R为回变菌落数；MR为致突变比值。
3．讨论
生物相容性是指材料与人体之间相互作用产生各种复杂的生物、物理、化学反应，以及人体对这些反应的忍受程度。根据ISO10993标准的要求，生物医学材料长期接触人体或植入人体内组织、血液应进行潜在的遗传毒性方面的生物学评价试验[6]。Ames试验是由美国的B.N.Ames在1975年建立的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验，是一种已被公认并广泛开展的致突变鉴定方法[7]。其实验原理是：鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型突变菌株(TAhis-)在缺乏组氨酸的培养基上，只有发生自发回变的少数菌落才能生长，如果受试物含有诱变物质则会导致回复突变增多从而表现为在缺乏组氨酸的培养基上生长的菌落数大大增加。此方法能够在短期内检测医用材料有无致突变性。
本实验将Nano-HA/PLLA/Fe2O3磁性纳米复合界面固定材料浸提液与各标准菌液混合后在最低营养板上培养，依据出现的回变菌落数及致突变比值来判断复合人工骨是否存在诱变物质。考虑到材料是用于植入人体的，为使实验条件更接近体内环境，以排除人体肝细胞微粒体酶系（S9）可能造成的激活诱变作用(间接诱变)，使得实验更具可信度，我们在实验中对把材料浸提液的检测分为S9（+）组和S9（—）组，观察用S9诱发后回变菌落数有无增加。另外，我们在操作及观察结果过程中注意严格无菌操作以排除杂菌污染，进而保证本试验结果的可靠性。
本试验结果显示：各菌株在各浓度待测液组中回变菌落平均数均未超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的2倍(MR<2)，显示该材料在有、无S9的情况下均无诱变活性；而阳性对照组各菌株回变菌落平均数均超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的2倍以上(MR>2)，证实鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型突变菌株对受试物的检测有效。本实验说明此nano-HA人工骨材料无遗传毒性作用，其用于体内植入是安全的，这为进一步动物实验及临床应用提供了依据。
参考文献
[1]JiangH,LiY,ZuoY,etal.PhysicalandchemicalpropertiesofsuperparamagneticFe-incorporatednanohydroxyapatite[J].JNanosciNanotechnol,2009,9（12）:6844-50.
[2]郝和平主编.生物医学材料生物学评价标准实施指南.北京:中国标准出版社，2000
[3]中国卫生部.生物材料和医疗器材生物学评价技术要求[S].北京:人民卫生出版社,1997,502～523.
[4]ISO10993（ISO/TC194）：Biologicalevaluationofmedicaldevices.
基金项目：1深圳市科技研发资金项目（编号：CXZZ20130321152713220）广东省卫生厅医学科研基金项目（B2012320）；广东省教育厅育才项目（2012LYM_0120）