重组质粒DNA的规模化生产工艺及质量鉴定研究

论文摘要

基因治疗和基因免疫是目前生物医药领域研究的热点之一,其中以表达目的基因重组质粒为基础的非病毒基因转移策略具有安全性好等突出优点,更加受到研究者的青睐。目前实验室制备重组质粒DNA不仅技术较为成熟,而且有众多的商品化试剂盒可供选用,但这些试剂盒不仅价格昂贵,而且不能满足大规模制备质粒DNA的需要。大规模制备既符合相关质量要求,价格又便宜的重组质粒DNA,特别是动物用重组质粒DNA,仍是制约核酸疫苗和基因治疗研究的瓶颈。目前,大规模制备质粒DNA的方法主要有阴离子交换、分子排阻、疏水色谱等层析方法,这些技术不仅需要用苯酚等有毒化学物质和具有潜在病原污染的动物源RNA酶对质粒DNA进行前处理,而且具有耗时、产量低和成本昂贵等缺点。为了解决动物基因免疫或基因治疗用重组质粒DNA的规模化生产工艺,本研究在筛选出具有价格优势的重组菌高密度发酵培养基配方的基础上,研究了不同重组质粒DNA转化大肠杆菌的发酵培养条件,发酵培养过程中宿主菌生长动态与质粒DNA复制的关系,并以150L发酵罐为标准,研究了不同发酵培养条件下重组质粒DNA的产量。结果表明,DH5α和JM109重组菌在筛选的发酵培养基中的生长动态及单位湿菌重比在进口试剂配制的标准LB培养基中要高,在生长对数中后期对重组菌进行42℃诱导,可显著提高质粒产量,其中JM109宿主菌较DH5α宿主菌的质粒产量约高20%。规模化生产重组质粒DNA的另一重要环节是重组菌的破碎处理和质粒DNA的纯化。目前常用的细菌破碎处理方法包括热裂解和碱溶解法,前者需要专门设计的仪器设备,裂解条件不易控制,后者不需专门设备,但生产成本较高。本研究对标准的重组大肠杆菌碱溶解法进行了改进,使其在不影响质粒产量和质量的前提下,制备成本明显下降。进而在公开发表的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 部分缩写的英文对照
• 综述：基因免疫用重组质粒DNA 生产工艺的研究进展
• 参考文献
• 研究内容一：用于质粒DNA 规模化生产的大肠杆菌发酵培养基的筛选
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 研究内容二：重组大肠杆菌连续传代及高密度发酵过程中质粒的遗传稳定性
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 研究内容三：重组大肠杆菌的高密度发酵放大工艺研究
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 研究内容四：重组大肠杆菌碱裂解方法的改进
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 研究内容五：CTAB 选择性沉淀质粒DNA 方法的改进及其纯化质粒的质量检验
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 研究内容六：改良CTAB 选择沉淀法纯化质粒的体外细胞转染效率
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 研究内容七：改良CTAB 选择沉淀法纯化质粒的体内表达研究
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 研究内容八：纯化质粒在动物体内的分布、残留及水平传播
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 攻读博士期间发表论文