蛋白质芯片快速可视化联检植物病原研究

论文摘要

蛋白质芯片,狭义的又称蛋白质阵列,按阵列样点大小,主要可分为微阵列和宏阵列两类。随着芯片技术的飞速发展,蛋白质芯片已越来越多的应用于生物科学各领域。在动植物生长过程中,常发生多种病原同时感染某一宿主的情况,传统方法通常以免疫学、分子生物学等方法,单通路、逐个的检测目标病原,具有耗时费力、成本高的缺陷。基于双抗体夹心检测抗原的原理,本研究利用蛋白质芯片技术,将分别针对多种病原的捕获抗体点样排布在硝酸纤维素膜基片,利用捕获抗体特异性结合目标抗原,进一步与碱性磷酸酶标记的检测抗体反应,最后以化学显色方法显示信号,从而实现一次实验快速可视化联检10种茄科植物病原。在灵敏度测试实验中,蛋白质芯片对其中至少8种病原的单检灵敏度,要明显优于或等同于传统微孔板ELISA法。以蛋白质芯片检测实际植物样品,结果与ELISA吻合度高达100%(240/240),说明本研究建立的蛋白质芯片具良好的实际检测能力。进一步构建针对西瓜果斑病菌的蛋白质宏阵列,对标准纯菌液的检测灵敏度可达2.3×105cfu/mL,且同时具有优异的特异性和重复性检测性能。蛋白质芯片技术,不仅有类似ELISA等传统方法的单通路检测能力,还有传统方法所不具备的多通路同时检测能力。利用蛋白质芯片检测,检测样品不需特殊处理,可有效避免基因芯片检测中的核酸提取、反转录、分子标记等操作,全检测过程只需少量的基本仪器即可完成,检测结果既可用肉眼直接定性判定,也可通过普通平板扫描仪获取后作半定量、定量分析,可有效降低检测成本,推广前景广阔。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 蛋白质芯片的构建与应用进展
• 1.1 蛋白质芯片技术的原理与分类
• 1.2 蛋白质阵列的制备
• 1.2.1 基片选择
• 1.2.2 芯片点样
• 1.2.3 固定
• 1.3 蛋白质芯片的信号检测
• 1.3.1 直接检测
• 1.3.2 间接检测
• 1.4 蛋白质芯片的应用
• 1.4.1 蛋白质组学
• 1.4.2 疾病诊断
• 1.4.3 药物研发
• 1.4.4 食品安全
• 1.4.5 作物生产
• 第二章 应用蛋白质阵列同时检测茄科植物10种主要病原
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试剂与耗材
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 溶液配制
• 2.2.4 双抗体夹心ELISA
• 2.2.5 蛋白宏阵列的构建
• 2.2.6 阵列反应过程
• 2.3 结果
• 2.3.1 抗体筛选
• 2.3.2 点样缓冲液及抗体点样浓度的选择
• 2.3.3 封闭条件的优化
• 2.3.4 蛋白宏阵列和ELISA单独检测的灵敏度对比
• 2.3.5 蛋白宏阵列同时检测病原的能力
• 2.3.6 蛋白宏阵列检测实际样品
• 2.4 讨论
• 第三章 应用蛋白质宏阵列定量检测西瓜细菌性果斑病菌
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂与耗材
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 溶液配制
• 3.2.4 细菌悬液的准备
• 3.2.5 蛋白宏阵列的构建与使用
• 3.2.6 特异性测试
• 3.2.7 灵敏度测试
• 3.2.8 重复性验证
• 3.3 结果
• 3.3.1 Aac梯度纯菌液的计数结果
• 3.3.2 特异性测试结果
• 3.3.3 灵敏度测试结果
• 3.3.4 重复性验证结果
• 3.3.5 对实际样品的检测
• 3.4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间的研究成果
• 致谢