猪原始生殖细胞体内跟踪、体外培养及遗传印记的研究

论文摘要

胚胎生殖细胞（EG）是从胎儿原始生殖细胞（PGCs）分离培养出来的具有发育多潜能性的一种多潜能干细胞。传统的胚胎干细胞（ES）多从囊胚的内细胞团（ICM）获得,如小鼠ES。但对大家畜而言,很难获得充足的囊胚,ES建系也还没有成功。自从PGCs来源的小鼠EG细胞建立后,通过检测mEG的生物学特性和mES相似,使人们有理由相信,由其他物种的PGCs也同样能够获得EG细胞。虽然关于猪EG细胞的获得早有报道,但是,至今仍然未能建成与小鼠ES和EG一样稳定的细胞系。原因是多方面的,一是我们对猪PGCs的发生、增殖、迁移等过程缺少了解；二是我们对猪PGCs的表观遗传学变化研究甚少;三是PGCs细胞体外培养体系仍有待完善。本研究选择猪胚胎发育22天至30天的生殖嵴为研究对象,通过组织切片技术对生殖嵴形态及PGCs在体内的迁移进行了跟踪；利用Realtime PCR及亚硫酸氢盐测序技术对印记基因的表达及甲基化水平进行了分析；通过对不同胎龄、不同饲养层、不同的传代方法的比较对类EG细胞的培养条件进行了优化,期望在认知猪PGCs体内生物学变化规律的基础上优化体外培养条件,最终获得稳定传代的猪EG细胞系。主要研究结果如下：（1）组织切片HE染色法跟踪了猪生殖嵴形态变化。在胚胎发育的22天还没有形成生殖嵴；24天,中肾内侧壁局部增厚；26天,已经能够看到明显的两条细长的索状结构出现；28天,中肾内侧壁继续增厚,生殖嵴变大,凸向体腔；30天,生殖嵴发育形成可以独立分离的结构,凸向体腔。（2）Oct、Stella及Fragilis三个生殖细胞特异标记物对PGCs进行了体内跟踪。胚龄22天,生殖嵴及附近没有观察到PGCs;24天,尽管中肾内侧壁增厚,但是也未发现PGCs;26天,可见少量PGCs进入生殖嵴,但是大部分PGCs还在生殖嵴附近的肠系膜处；28天,PGCs大部分已经进入到生殖嵴；胚胎发育第30天时,PGCs几乎全部进入生殖嵴而且有聚集的趋势。（3）通过Realtime PCR的方法,分析了印记基因Igf2、H19、Xis、Peg3、Grb10、Diras3及Plagll在PGCs中的表达,结果显示,Igf2、H19及Diras3基因在22及24天的表达量明显低于26天,Grb10在28天的表达量达到最高。雌性PGCs中Xist基因在30天时表达量明显升高。（4）采用亚硫酸氢盐测序的方法,分析了22-30天PGCs中Igf2和H19两个印记基因的甲基化情况。实验结果显示,在26天前二者DMR的甲基化呈逐渐降低的趋势,26天达到最低：之后,甲基化水平逐渐升高。Igf2和H19两个印记基因在体外培养的类EG细胞中呈高甲基化状态。（5）本研究分离了不同阶段的PGCs进行体外培养,从胚胎发育24-28天的PGCs得到了类EG细胞,而在22和30天的胚胎中我们并没有观察到明显的克隆形成。比较24、26和28天的细胞克隆数及传代能力,26天的PGCs用于类EG培养具有优势。（6）本研究通过比较小鼠成纤维细胞、猪胎儿成纤维细胞及猪性腺-中肾区基质细胞共培养的方法,在原代培养中,性腺-中肾区基质细胞的培养效果要好于其它两种,而在传代培养中,三者的差异并不显著。最终采用与猪性腺-中肾区基质细胞共培养的方法得到了类EG细胞,但所得的类EG细胞在体外最高传至12代,并未建立稳定的能够体外长期传代的猪EG细胞系,说明我们的培养条件还是不够理想,仍需继续优化。（7）Realtime PCR及免疫荧光检测证明猪类EG细胞表达多能性基因Oct4、Sox2及Nanog;免疫荧光检测证明其表达胚胎阶段特异性抗原SSEA3和SSEA4; TRAP-PCR检测表明猪类EG细胞具有端粒酶活性;Realtime PCR检测证明EG细胞有Xist基因的表达。（8）本研究通过EG细胞延迟传代自发分化得到了具有上皮样、成纤维样及神经样的细胞；通过EG细胞体外悬浮培养形成拟胚体,贴壁培养后能够分化成具有三个不同胚层来源细胞特征的细胞,显示得到的类EG细胞具有多向分化潜能。（9）本研究通过EG细胞体外定向诱导分化,得到了具有向成骨细胞、成脂细胞及神经细胞分化的细胞,进一步说明了猪EG细胞的多向分化潜能。总之,本研究从妊娠24～26天猪的PGCs获得了具有一定传代能力的猪EG细胞,并且证实了猪EG体外具有体外多向分化潜能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 猪多能干细胞研究进展
• 1.1.1 胚胎干细胞（ES）的研究进展
• 1.1.2 诱导多能干细胞（iPS）的研究进展
• 1.1.3 胚胎生殖细胞（EG）的研究进展
• 1.2 哺乳动物原始生殖细胞的发育
• 1.2.1 原始生殖细胞特化的信号调控
• 1.2.2 小鼠原始生殖细胞的迁移
• 1.2.3 人原始生殖细胞的迁移
• 1.2.4 猪原始生殖细胞的迁移
• 1.2.5 原始生殖细胞甲基化的去除与重建
• 1.3 胚胎生殖细胞培养的影响因素
• 1.3.1 饲养层对胚胎生殖细胞的影响
• 1.3.2 细胞生长因子对胚胎生殖细胞的影响
• 1.3.3 胚胎日龄对胚胎生殖细胞的影响
• 1.3.4 分离方法对胚胎生殖细胞的影响
• 1.3.5 胚胎生殖细胞的传代
• 1.3.6 胚胎生殖细胞的鉴定
• 1.4 本研究的目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂及试剂盒
• 2.1.4 常用试剂及配制
• 2.1.5 主要的生物信息学网站及分析软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 猪生殖嵴组织学切片制作
• 2.2.2 苏木素-伊红染色
• 2.2.3 组织切片免疫荧光
• 2.2.4 猪原始生殖细胞的分离
• 2.2.5 Realtime PCR
• 2.2.6 亚硫酸氢盐修饰后测序的甲基化分析
• 2.2.7 胚胎生殖细胞培养用饲养层的制备
• 2.2.8 胚胎生殖细胞的原代培养
• 2.2.9 胚胎生殖细胞的传代培养
• 2.2.10 猪胚胎生殖细胞的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 猪生殖嵴形态变化及原始生殖细胞跟踪
• 3.1.1 猪生殖嵴形态变化跟踪
• 3.1.2 猪原始生殖细胞在体内迁移跟踪
• 3.2 猪原始生殖细胞印记基因表达的变化
• 3.2.1 Realtime PCR反应的特异性
• 3.2.2 印记基因的表达
• 3.3 猪原始生殖细胞印记基因甲基化的变化
• 3.3.1 IGF2基因的甲基化
• 3.3.2 H19基因的甲基化
• 3.4 猪胚胎生殖细胞的培养
• 3.4.1 饲养层细胞的形态特征
• 3.4.2 胚胎生殖细胞的形态特征
• 3.4.3 不同胚胎日龄对胚胎生殖细胞培养的影响
• 3.4.4 不同来源饲养层对胚胎生殖细胞培养的影响
• 3.4.5 不同传代方式对胚胎生殖细胞培养的影响
• 3.4.6 胚胎生殖细胞的鉴定
• 4 讨论
• 4.1 猪原始生殖细胞的迁移
• 4.1.1 生殖嵴的形成
• 4.1.2 原始生殖细胞的迁移
• 4.2 印记基因的研究
• 4.2.1 DNA甲基化与基因表达
• 4.2.2 印记基因的甲基化
• 4.3 胚胎生殖细胞培养的影响因素
• 4.3.1 饲养层细胞对胚胎生殖细胞培养的影响
• 4.3.2 胚胎日龄对胚胎生殖细胞培养的影响
• 4.3.3 胚胎生殖细胞的定向诱导分化
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的学术论文