烟草核基质结合（MAR）序列的机理研究和应用

论文摘要

转基因技术广泛应用于物种改良和分子生物学的基础研究领域,随着大量转基因植株的获得,人们发现外源基因沉默和外源基因表达量过低的问题普遍存在。造成这一现象的原因很多,主要有甲基化、位置效应、共抑制、染色体包装方式及反式作用等。如何克服转基因沉默是完善转基因技术的关键。近年来发现,将MAR序列构建到表达盒两翼不仅可以克服基因沉默、增强外源基因表达,还可以促进外源基因在后代中的稳定遗传。因而,MAR序列作为一种很有效的基因表达顺式调控元件,具有良好增强效果,MAR序列构建的高效表达载体对于优化转基因技术有非常重要的意义。本实验选用了烟草的两个MAR 序列:TM2 和220MAR。TM2 是由本实验室首次克隆并注册的烟草强核基质结合序列,基因注册号为AF373415。220MAR 是Spiker 实验室用体外结合实验的方法从烟草核基质中分离得到的MAR 序列。因此,本实验将TM2 和220MAR 分别连接到三个启动子驱动的标记基因GUS 或GFP 的表达盒两翼,研究TM2和220MAR 对遗传转化频率和外源基因表达水平的影响,以上三个启动子分别为:双子叶植物的CaMV35S 组成型启动子,单子叶植物的Ubi 组成型启动子和本实验室从裂叶矮牵牛基因组中克隆得到的PNZIP 叶片特异型启动子,具体试验结果如下: 1.将TM2 以顺式重复方向分别插入到pBI121、pCAMBIA1301 的启动子上游和标记基因GUS 的下游,以及改造过的pBI121、pCAMBIA1301 的启动子上游和标记基因GUS 的下游,使TM2 位于表达盒的两翼构建了CaMV35S 启动子、PNZIP 启动子控制的两个双子叶植物表达载体和Ubi 启动子、PNZIP 启动子控制的两个单子叶植物表达

论文目录

• 摘 要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 植物基因工程表达载体的改进和优化策略
• 1.1.1 转基因植物研究现状
• 1.1.2 高效植物表达载体的构建
• 1.2 MAR 在基因工程中的应用
• 1.2.1 MAR 的分离鉴定
• 1.2.2 MAR 序列的特征
• 1.2.3 MAR 的序列结合蛋白
• 1.2.4 MAR 对外源基因转化频率和表达水平的影响
• 1.2.4.1 MAR 对外源基因转化频率的影响
• 1.2.4.2 MAR 对外源基因表达水平高低的影响
• 1.2.5 ARS 元件在基因工程中的应用
• 1.2.5.1 ARS 元件分离和序列特征
• 1.2.5.2 ARS 功能
• 1.2.5.3 ARS 序列与 MAR 序列的关系
• 1.2.6 MAR 序列作用的分子机理
• 1.2.6.1 MAR序列与Loop环模型
• 1.2.6.2 MAR 序列作用的其它模型
• 1.3 本课题的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 烟草和水稻基因组DNA 的提取（小量法）
• 2.2.2 烟草 MAR 序列的扩增
• 2.2.3 PCR 产物与克隆载体的连接
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5 转化与筛选
• 2.2.6 碱法小量提取质粒 DNA
• 2.2.7 碱法大量提取质粒DNA
• 2.2.8 载体去磷酸化
• 2.2.9 目的片段的凝胶回收
• 2.2.10 农感菌感受态细胞的制备
• 2.2.11 冻融法转化农杆菌
• 2.2.12 农杆菌的培养
• 2.2.13 植物表达载体的构建
• 2.2.13.1 正向插入 TM2 的烟草表达载体的构建
• 2.2.13.2 正向插入 TM2 的水稻表达载体的构建
• 2.2.13.3 正向插入220MAR的烟草表达载体的构建
• 2.2.14 基因枪法转化烟草悬浮细胞
• 2.2.15 农杆菌介导的烟草转化
• 2.2.16 农杆菌介导的水稻转化
• 2.2.17 转基因烟草和水稻 PCR 检测
• 2.2.18 转基因烟草的 GUS 组织分析
• 2.2.19 转基因烟草和水稻的GUS 活性分析
• 2.2.19.1 新鲜的植物组织 GUS 蛋白的提取
• 2.2.19.2 GUS 蛋白提取液蛋白含量测定（Bradford 法）
• 2.2.19.3 GUS 酶活反应
• 2.2.19.4 荧光测定
• 2.2.19.5 酶活力计算
• 2.2.20 转基因植株的 Southern 杂交
• 2.2.20.1 植物基因组 DNA 的制备
• 2.2.20.2 限制性内切酶消化
• 2.2.20.3 转膜
• 2.2.20.4 预杂交
• 2.2.20.5 探针合成
• 2.2.20.6 洗膜及显影
• 2.2.21 转基因植株的 Northern 杂交
• 2.2.21.1 RNA 提取
• 2.2.21.2 RNA 甲醛变性凝胶电泳
• 2.2.21.3 转膜及烘膜
• 2.2.21.4 杂交
• 2.2.21.5 洗膜及压片
• 2.2.22 MAR 序列侧翼序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 TM2 对转基因效率的影响
• 3.1.1 TM2 对烟草转化的影响
• 3.1.1.1 烟草表达载体的构建
• 3.1.1.2 农杆菌介导的烟草转化
• 3.1.1.3 TM2对烟草转化频率的影响
• 3.1.1.4 转基因烟草植株的 PCR 鉴定
• 3.1.1.5 转基因烟草 GUS 酶活测定
• 3.1.2 TM2 对水稻转化的影响
• 3.1.2.1 水稻表达载体的构建
• 3.1.2.2 农杆菌介导的水稻转化
• 3.1.2.3 TM2 对水稻转化频率的影响
• 3.1.2.4 转基因水稻植株的 PCR 鉴定
• 3.1.2.5 转基因水稻的 GUS 酶活测定
• 3.1.3 TM2 提高转化频率的机理研究
• 3.1.3.1 部分转基因植株的 Southern 分析
• 3.1.3.2 部分转基因植株的 Northern 分析
• 3.2 220MAR 对转基因表达水平和转化效率的影响
• 3.2.1 220MAR 烟草表达载体的构建
• 3.2.2 220MAR 对转基因烟草瞬时表达的影响
• 3.2.3 220MAR对转基因烟草稳定表达的影响
• 3.2.3.1 220MAR 对烟草转化频率的影响
• 3.2.3.2 基因植株的PCR鉴定
• 3.2.3.3 转基因烟草植株的组织化学染色
• 3.2.3.4 转基因烟草的GUS 酶活测定
• 3.3 MAR 侧翼序列的扩增
• 3.3.1 野生烟草植株的 Southern 杂交分析
• 3.3.2 反向 PCR（IPCR）扩增 TM2 侧翼序列
• 4 讨论
• 4.1 TM2 对转基因表达水平和转化效率的影响
• 4.2 220MAR 对转基因表达水平和转化效率的影响
• 4.3 高效表达载体构建
• 4.4 展望
• 5 结论
• 6 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 硕士期间发表的主要学术论文