论文摘要
目的采用体外分离、培养人骨髓间充质干细胞（human Mesenchymal stem cells, h-MSCs）,以及用碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）和不同浓度的睫状神经节神经营养因子（ciliary neurotrophic factor,CNTF）对其进行预诱导及诱导,通过观察细胞形态学变化,及免疫细胞化学染色CD34、CD44、CD54、NSE和Nestin的表达,探讨建立一种较简便有效的体外扩增培养h-MSCs的体系,以及CNTF对h-MSCs分化为神经元样细胞的诱导作用和适宜的诱导浓度。方法骨髓来源于南华大学附属第二医院和第一医院血液内科行骨髓穿刺检查患者（经患者同意）,已排除肿瘤、传染病及血液系统疾病,年龄18～55岁,性别不限,男39例,女29例,共68例。采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁法相结合的方法,分离获得h-MSCs,利用含血清的DMEM/F12培养基体外扩增,以及细胞冻存、复苏。相差倒置显微镜下观察细胞形态学变化,并绘制第1、3、6代h-MSCs的生长曲线。取传至第3代的h-MSCs,分为4组进行诱导分化:实验组、单纯预诱导组、单纯诱导组和空白对照组。实验组以bFGF预诱导24h后,再以5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL浓度梯度的CNTF诱导12h;单纯预诱导组仅行bFGF预诱导而无CNTF诱导;单纯诱导组不经bFGF预诱导仅行CNTF诱导,诱导液中的CNTF亦分为3个浓度梯度（5ng/mL、10ng/mL和20ng/mL）;空白对照组为无处理组,既无bFGF预诱导亦无CNTF诱导。应用免疫细胞化学技术对培养的h-MSCs进行CD34、CD44和CD54鉴定及对诱导分化后的细胞进行NSE和Nestin鉴定。结果1.h-MSCs在体外培养条件下,呈长梭形,类似成纤维细胞,可稳定增值传代并可冻存复苏,复苏后细胞生长特性与冻存前的细胞相似;2.第1、3、6代h-MSCs生长曲线呈“S”形。第1代与第3代的细胞浓度比较差异无统计学意义（P=0.704）,第1代与第6代比较差异无统计学意义（P=0.132）,第3代与第6代比较差异亦无统计学意义（P=0.256）;3.应用免疫细胞化学技术检测培养的h-MSCs,显示CD44, CD54均呈阳性表达,CD34表达呈阴性;4.h-MSCs在bFGF预诱导24h后,细胞形态基本无改变。CNTF诱导5h后部分细胞体积变小,以细胞核为中心收缩,逐渐呈锥形,形成突起。CNTF诱导12h后,实验组中10ng/mLCNTF组和20ng/mLCNTF组细胞形态改变明显,有2个或多个细长突起,类似神经元;5ng/mLCNTF亚组仅有少部分细胞形态稍发生变化。空白对照组、单纯预诱导组和单纯诱导组的细胞形态基本无改变,仍为宽大扁平的梭形。5.免疫细胞化学检测显示诱导后的细胞神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）和巢蛋白（Nestin）均呈阳性表达。各组阳性细胞率间比较,差异均有统计学意义（F=98.822,F=105.395,均P<0.01）;实验组与空白对照组、单纯预诱导组及单纯诱导组比较,差异均有统计学意义（均P<0.01）,但后三组之间比较差异无统计学意义（均P>0.01）;实验组内两两之间比较显示,20ng/mL组与10ng/mL组阳性细胞率差异无统计学意义（P=0.413,P=0.496）,但均高于5ng/mL组（均P<0.01）。10ng/mLCNTF实验组NSE阳性细胞率（46.38±4.99）%,Nestin阳性细胞率（45.76±4.46）%,为最多。结论1.梯度离心法和全骨髓贴壁法相结合的方法,是一个较简便有效的体外h-MSCs培养、纯化体系;2. h-MSCs可在体外培养扩增,并可冻存、复苏,复苏后的细胞生长特性与冻存前的细胞相似;3.在本实验条件下,CNTF可诱导h-MSCs定向分化为神经元样细胞;且10ng/mLCNTF可能为较适宜的诱导浓度。
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标签：骨髓间充质干细胞论文; 细胞培养技术论文; 神经元论文; 睫状神经节神经营养因子论文; 碱性成纤维细胞生长因子论文;