重组免疫毒素ScFv-PE40在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定

论文摘要

猪囊尾蚴病是危害最为严重的人畜共患寄生虫病之一,该病不仅造成巨大的经济损失,而且对人类存在着重要的健康隐患。人不仅是中间宿主,而且是唯一的终末宿主。囊尾蚴常在脑、眼、心脏等重要器官寄生,其中以寄生于神经系统的脑囊虫病引起的临床症状最为严重,极大危害了人类健康。多年来防治本病主要是以药物防治为主,但是由于抗药性的不断出现以及药物残留等问题的严重性,使得利用免疫预防技术来取代药物成为控制猪囊尾蚴病的必然,且在寄生虫学界已达成了共识。课题组已经获得抗猪囊尾蚴头节抗原的单克隆抗体,并从抗体中已提取单链抗体ScFv,且与绿脓杆菌外毒素PE40链接并克隆到质粒载体pET28a中。本试验目的:通过重组免疫毒素基因ScFv-PE40在大肠杆菌BL21中表达及纯化,以获得具有一定纯度的重组免疫毒素,从而进行体外六钩蚴杀伤实验,验证重组免疫毒素的杀伤效果,为进一步动物实验和重组毒素的应用奠定基础,也为囊尾蚴病的预防和治疗提供理论依据。方法:首先通过CaCl2法制作感受态大肠杆菌BL21,将含有抗囊尾蚴头节的单链抗体基因（ScFv）和绿脓杆菌外毒素基因（PE40）的重组质粒载体pET-28a转化到大肠杆菌BL21中,培养后,将菌液铺于含有卡那霉素的LB固体培养基上37℃过夜,次日观察菌落,并挑取12个菌落分别培养后,提取质粒,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,进而进行特异性的IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western-Blotting分析鉴定,以检测蛋白的反应原性。将目的蛋白通过金属Ni2+亲和层析柱纯化,纯化后,通过体外六钩蚴杀伤实验检测目的蛋白的杀伤作用,同时绘制杀伤曲线,为进一步的活体动物实验奠定基础,同时也为囊尾蚴疾病的预防和治疗提供理论依据。结果:将含有pET28-ScFv-PE40的重组质粒转化到大肠杆菌BL21中后,提取质粒,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,经琼脂糖凝胶电泳,在约5400bp处和约1800bp处各有一条核酸条带,核酸长度与事先序列测定长度相同,说明菌中所含质粒为目的质粒。将E.coli BL21（DE3）通过IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析,ScFv-PE40基因获得了表达,各小时的表达量几乎无差别,表达蛋白的相对分子量约为68kDa（3.5 kDa的pET-28a肽段和68 kDaScFv-PE40）,表达量约占菌体总蛋白的13.8%。而含空质粒pET-28a的对照组则未见大小一致的蛋白质表达。为了进一步鉴定表达产物,将表达的蛋白质电转移至PVDF转移膜上,进行蛋白质印迹分析,可见68 kDa处有一条明显的蛋白印迹带,说明目的蛋白具有一定的反应原性。通过金属Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白后,在约68×103处有一条蛋白富集带,位置与融合蛋白pET28-ScFv-PE40的表达蛋白相一致。SDS-PAGE分析表明,纯化后目的蛋白的纯度在95%以上,可溶性蛋白的回收率约为50%,回收量为5mg/L。将纯化的目的蛋白进行体外六钩蚴杀伤实验,并绘制杀伤曲线。由细胞杀伤曲线可得,随着时间的推移,处理组和对照组形态完整六钩蚴的数目均呈逐渐减少趋势,但加入重组毒素组形态完整六钩蚴数目的下降明显快于对照组（P＜0.05）,并且比较三个杀伤曲线,可见随着重组免疫毒素剂量的减少,处理组下降逐渐减慢,表明重组毒素对六钩蚴具有较强的杀灭作用,但是重组毒素对六钩蚴的作用有一定的剂量依赖性。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1 猪囊尾蚴病的流行、分布及危害
• 1.1 流行因素
• 1.2 猪囊尾蚴病的分布
• 1.3 猪囊尾蚴病的危害
• 2 本研究的目的和意义
• 第一篇 文献综述
• 第一章 重组免疫毒素的组成及作用机制
• 1 传统的免疫毒素
• 2 基因重组免疫毒素
• 2.1 重组免疫毒素的弹头设计及作用机制
• 2.2 载体选择
• 2.3 重组免疫毒素的制备
• 2.4 靶向目标与策略
• 第二章 猪囊尾蚴病病原入侵与免疫机制研究进展
• 1 病原入侵致病作用及免疫逃避机制
• 1.1 病原入侵与致病机制
• 1.2 病原感染时的机体免疫反应
• 2 囊尾蚴免疫抑制及免疫逃避机制的研究进展
• 2.1 传统免疫抑制机理
• 2.2 功能性蛋白酶类的作用机制
• 2.3 蛋白酶抑制剂作用机制
• 2.4 易化免疫（facilitateimmune）逃避机制
• 3 研究猪囊尾蚴逃避机制的意义和今后的方向
• 第二篇 研究内容
• 实验一 重组免疫毒素SCFV-PE40在大肠杆菌中的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 大肠杆菌 BL21中重组质粒的酶切鉴定
• 2.2 重组质粒 PCR鉴定结果
• 2.3 SDS-PAGE分析
• 2.4 Western blot分析
• 3 讨论
• 3.1 质粒载体pET28a
• 3.2 表达系统的选择
• 3.3 影响外源基因表达效率的因素
• 3.4 目的基因的表达
• 3.5 目的蛋白的纯化
• 3.6 关于免疫印迹
• 3.7 目的蛋白的活性
• 4 小结
• 实验二 重组免疫毒素的亲和纯化及活性测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2+亲和层析纯化pET28-ScFv-PE40的特异性融合蛋白'>2.1 Ni²⁺亲和层析纯化pET28-ScFv-PE40的特异性融合蛋白
• 2.2 重组毒素活性测定结果
• 3 讨论
• 3.1 重组蛋白的亲和层析纯化
• 3.2 六钩蚴体外杀伤实验
• 3.3 抗囊尾蚴头节重组毒素 ScFv-PE40活性的测定
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 1 缩略语表
• 2 溶液的配制
• 致谢
• 个人简介