苏云金芽胞杆菌新型vip3基因克隆、表达及活性分析

论文摘要

农业害虫的危害一直都是我国农业面临的重大难题。我们长期以来大量施用化学农药防治农业害虫。然而由于化学农药的滥用,给人类的健康和环境造成了巨大威胁,同时害虫产生了抗药性,导致田间用药量不断增加,不仅防治成本大幅度的提高,对环境的污染也进一步加重。生物防治是解决这些问题的有效途径之一。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。具有杀虫活性主要是因为其产生多种具有杀虫活性的蛋白质,如杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)和营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins, VIPs)。VIPs是一类在营养期分泌的新型杀虫毒蛋白,与任何已知的杀虫晶体蛋白没有同源性,其杀虫机理也不同于已知的杀虫晶体蛋白。VIPs蛋白单独或是与Cry蛋白协同作用,以及组建融合基因构建工程菌,都可以扩大Bt杀虫谱,同时可以抑制害虫抗药性的产生。本研究对72株苏云金芽胞杆菌标准菌株进行vip3类基因型的鉴定,PCR鉴定呈阳性的有18株。利用高分辨熔解曲线(high resolution melting, HRM)检测PCR产物,由于扩增产物的碱基组成不同,不同类型的基因产生不同的熔解曲线,从而对所含有的vip3基因进行了分型。经熔解曲线类型分析,18株阳性菌株中的vip3基因大致分为8种类型。该方法可以高通量地进行基因分型,特别是可以同时检测出已知和新型的vip3类基因。根据已知vip3基因序列设计了PCR引物,成功克隆了五个vip3基因。提交至GeneBank并被国际Bt命名委员会正式命名为vip3Aa38、vip3Aa39、vip3Af3、vip3Ag3和vip3Ba2。将vip3基因全长片段插入表达载体pEB中,低温条件下在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,表达产物为88kDa左右的蛋白。将表达的蛋白进行了对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾四种鳞翅目昆虫的生物活性测定。Vip3Aa39蛋白对四种昆虫具有较高的毒力。Vip3Aa39蛋白与本实验室此前获得的Vip3Aa11蛋白进行比较,发现两者存在39个氨基酸的差异。用两种蛋白的表达产物分别进行了对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫和甜菜夜蛾的杀虫活性测定,结果表明Vip3Aa39对小地老虎有较高的杀虫活性,LC50为5.43μg/ml,而Vip3Aa11的LC50为73.62μg/ml;Vip3Aa39对小菜蛾具有较高的杀虫活性,LC50为140.64μg/ml,而Vip3Aa11对小菜蛾杀虫活性极低;Vip3Aa11对棉铃虫具有较高的杀虫活性,LC50为35.18μg/ml,而Vip3Aa39的LC50仅为286.99μg/ml;Vip3Aa39和Vip3Aa11均对甜菜夜蛾具有高毒力,LC50分别为2.02μg/ml和2.04μg/ml。以上结果说明Vip3Aa39与Vip3Aa11对小地老虎、小菜蛾、棉铃虫的杀虫活性具有显著不同。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1. 引言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌
• 1.2 杀虫晶体蛋白
• 1.2.1 杀虫晶体蛋白的类型
• 1.2.2 杀虫晶体蛋白的作用机制
• 1.2.3 杀虫晶体蛋白的应用
• 1.3 营养期杀虫蛋白
• 1.3.1 营养期杀虫蛋白的分类及杀虫活性
• 1.3.2 营养期杀虫蛋白的作用机理
• 1.3.3 Vip3 蛋白与Cry 蛋白间协同增效作用
• 1.3.4 营养期杀虫蛋白的应用前景
• 1.4 杀虫蛋白基因鉴定方法
• 1.4.1 PCR-RFLP 鉴定
• 1.4.2 多重PCR 鉴定
• 1.4.3 基因组测序
• 1.4.4 核酸分子杂交鉴定
• 1.4.5 蛋白鉴定
• 1.4.6 高分辨熔点系统检测法
• 1.5 重要农业害虫
• 1.5.1 小地老虎
• 1.5.2 小菜蛾
• 1.5.3 棉铃虫
• 1.5.4 甜菜夜蛾
• 1.6 本研究的立题依据和目的意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 供试昆虫
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 晶体形态观察
• 2.2.3 PCR 反应
• 2.2.4 酶切体系
• 2.2.5 高分辨熔解曲线鉴定vip3 基因
• 2.2.6 E.coli 质粒DNA 提取
• 2.2.7 Bt 总DNA 提取
• 2.2.8 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.9 DNA 回收
• 2.2.10 连接反应
• 2.2.11 E.coli 感受态细胞制备
• 2.2.12 热击转化
• 2.2.13 vip3 基因在E.coli 中诱导表达
• 2.2.14 SDS-PAGE 电泳
• 2.2.15 序列测定及分析
• 2.2.16 杀虫活性测定及数据处理
• 3. 结果与分析
• 3.1 vip3 类基因的鉴定
• 3.1.1 PCR 鉴定
• 3.1.2 HRM 检测
• 3.1.3 测序分析
• 3.2 菌株生物学特性
• 3.3 vip3 类基因的克隆及序列分析
• 3.3.1 vip3Aa 基因的克隆及序列分析
• 3.3.2 vip3Ag 基因的克隆及序列分析
• 3.3.3 vip3Af 基因的克隆及序列分析
• 3.3.4 vip3Ba 基因的克隆及序列分析
• 3.3.5 Vip3 蛋白的同源性比较
• 3.4 vip3 类基因异源表达
• 3.4.1 vip3 类基因异源表达载体的构建
• 3.4.2 vip3 类新基因在大肠杆菌异源表达
• 3.5 Vip3 类蛋白杀虫活性的研究
• 3.6 Vip3Aa39 和Vip3Aa11 蛋白的比较
• 3.6.1 Vip3Aa39 和Vip3Aa11 蛋白氨基酸的差异
• 3.6.2 vip3Aa39 和vip3Aa11 基因的异源表达
• 3.6.3 Vip3Aa39 和Vip3Aa11 杀虫活性的比较
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文