水稻磷素吸收的生理和分子基础研究

论文摘要

磷素是植物必需的大量无机营养元素,是核酸、磷脂和ATP等生命大分子的重要组分。提高作物对土壤中磷素和施用磷肥的利用效率,对于促进农业的可持续发展具有重要意义。本项研究针对目前有关水稻磷效率生理和分子机制有待深化的现状,以典型粳稻品种为材料,开展了水稻耐低磷能力基因型差异及其生理基础、水稻应答磷胁迫特异表达基因鉴定和介导植株磷素吸收、转运的水稻磷转运蛋白基因（OsPT2和OsPT4）分子特征、表达特性和功能的研究。主要研究结果如下:1.以10个粳稻品种为材料,研究了不同供磷水平下供试品种的生长和磷素吸收特性。结果表明,缺磷（20μM Pi）条件下,供试水稻品种单株磷累积量具有较大差异,可划分为高效、中效和低效三种类型。单株干重和全磷含量与单株磷累积量在缺磷条件下呈显著或极显著正相关。表明缺磷条件下植株生长状况与吸磷能力强弱具有紧密联系。缺磷条件下,供试水稻株高、单株叶面积与单株磷累积量表现趋势相同,但单株根数、平均根长和根系体积与磷素吸收关系不密切。研究表明,磷胁迫条件下根系的磷吸收能力,是影响水稻品种磷吸收量的主要原因。缺磷条件下吸磷量相对增多,是磷高效品种植株性状相对改善的重要生物学基础。2.以磷高效品种TP309和优质8号、中效品种垦优2000和新90-3及低效品种9618和早88-1为材料,研究了缺磷条件下供试品种的光合特性和细胞保护酶活性。缺磷条件下,随植株生长进程,供试品种的光合速率（Pn）均不断下降;但在同一测定时期以磷高效品种最高,中效品种次之,低效品种最低。单株叶面积表现特征与Pn不尽不同。缺磷条件下,叶绿素（Chl）含量、可溶蛋白含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性也表现为随品种磷吸收效率提高而增大,丙二醛（MDA）含量则相反。气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）则与磷效率不具相关性。Pn、Chl、可溶蛋白含量和SOD活性与单株磷累积量均呈显著或极显著正相关,MDA与单株磷累积量呈显著负相关。表明可用上述生理生化参数作为鉴定水稻耐低磷能力的参考指标。研究表明,较强的SOD活性是高效供试品种在缺磷条件下细胞膜脂过氧化程度低的重要原因,并在维持光合器官功能中具有重要作用。3.采用cDNA-AFLP技术,鉴定了磷高效品种TP309在低磷胁迫下的特异表达基因。共鉴定特异表达基因54个,其中22个具有推定功能。已知功能基因分别归属于信号转导、转录调控、氨基酸合成、物质运输、逆境响应和蛋白质合成等6个功能类别。14-3-3类似蛋白基因（AF451190）在低磷胁迫下增强表达,可能对于增强质膜H+泵活力、进而增强在低磷胁迫下的磷素吸收中具有较重要作用。丝氨酸/苏氨酸激酶基因（AK100849）的表达受到低磷胁迫诱导,可能参与了胞内低磷逆境信号的转导过程。信号肽酶基因（AB066265）可能参与了胞内低磷逆境信号传递体中特定蛋白的剪切、加工,介导转至胞内低磷信号的进一步传递。本研究中,鉴定了bHLH型转录因子基因OsPTF1（AY238991）也呈低磷胁迫诱导表达。表明该转录因子在增强供试品种TP309在低磷胁迫条件下的磷素吸收和利用中具有较重要作用。此外,热激转录因子基因（AK065643）参与了下游低磷应答部分基因的转录调控。HAK8基因（AJ427977）上调表达,表明磷胁迫条件下植株的钾素吸收特征也发生一定改变。本研究鉴定了8个应答低磷逆境响应基因,有关上述基因的功能有待进一步探讨。研究表明,水稻对低磷胁迫的响应,存在着植株对低磷信号转导、特定基因的转录调节和植株在生理生化和形态学上对低磷应答等复杂的生物学过程。4.水稻磷转运蛋白基因OsPT2的编码阅读框为1587 bp,编码528个氨基酸,蛋白分子量57.84 kDa,等电点8.68。编码蛋白含有12个跨膜域。系统进化分析表明,OsPT2与水稻OsPT1、PT1、PTs1和OsPT3,及小麦PT8、大麦PT和玉米PT4高度同源。在正常供磷（CK,2 mM Pi）条件下,OsPT2在根系和叶片中均有表达,但以在叶中的表达水平较高。随着磷水平降低,OsPT2在根中的表达增强,在叶中的表达表现为随外界磷浓度变化保持稳定的组成型特征。在低磷（20μM Pi）条件下,在根中表达随着低磷处理时间延长不断增加。低NH4+对根叶中OsPT2的表达产生负向调控效应,但外界NO3-、K+、Fe2+和Zn2+浓度的变化对OsPT2的表达没有影响。OsPT2启动子中含有许多应答非生物逆境的调控元件,其中应答低磷胁迫逆境的PIBS可能与根系中OsPT2低磷增强表达有关。OsPT2启动子驱动报告基因Gus在不同磷水平下的表达结果,与OsPT2在相应磷水平下的表达特征相一致。对野生型植株（CK）和具有不同OsPT2表达水平的烟草转基因系1、4和6 T2植株研究表明,与CK相比,转基因烟草植株的全磷含量没有差异。但转基因系植株的单株干重、单株磷累积量和光合速率较CK均有不同程度的增加,表现为随植株中OsPT2表达水平提高,上述性状或参数数值不断增大。因此,异源表达OsPT2,具有增强植株在低磷胁迫条件下磷素吸收和改善植株光合碳同化能力的作用。5.水稻磷转运蛋白基因OsPT4的编码阅读框为1617 bp,编码538个氨基酸,蛋白分子量58.83 kDa,等电点8.24。OsPT4含有11个跨膜域,各跨膜域的氨基酸残基数量变化在1727之间。系统进化分析表明,OsPT4与水稻Pht11-2、PT5、小麦PT1、大麦HvPT4和玉米PT2具有较高的同源性。在不同供磷水平下,OsPT4在植株根系中均不表达,在叶片中的表达表现为随介质中磷水平降低不断增强。在低磷胁迫（20μM Pi）条件下,OsPT4在叶中的表达表现为,随着低磷处理时间延长表达水平呈不断增加趋势。叶中OsPT4对外界NH4+、NO3-、K+、Fe2+和Zn2+浓度的变化均不产生应答。研究表明,在OsPT4启动子中,不存在应答低磷胁迫逆境的重要调控元件PIBS,表明OsPT4在叶片中对低磷胁迫的上调应答,与未知的其他调控元件有关。研究发现,OsPT4启动子驱动报告基因Gus在不同磷水平下的表达结果,与OsPT4在相应磷水平下的表达特征相吻合。高表达OsPT4的转基因烟草植株（转基因系1、5和7）,与野生型植株（CK）相比,植株低磷处理后的磷累积量没有差异,全磷含量表现下降趋势。但转基因植株的单株干重和光合速率较对照显著增加。此外,通过单株干重和单株磷累积量的比值获得的磷利用效率表现为,高表达OsPT4的转基因烟草植株较CK显著增加。因此,异源表达水稻磷转运蛋白基因OsPT4,对植株在低磷胁迫条件下的磷素吸收能力没有影响,但具有改善植株体内磷素转运和增强低磷胁迫条件下植株磷利用效率的功能。

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摘要

Abstract

引言

1 植物磷效率的概念及遗传特性

2 低磷胁迫对植物形态特征及体内代谢影响

2.1 磷胁迫引起的根系形态构造的变异

2.2 低磷条件下植株体内激素水平的变化

2.3 缺磷对水分利用效率、碳水化合物同化作用的影响

2.4 磷胁迫对膜脂过氧化及保护酶系统活性的影响

2.5 磷酸酶活性与植物耐低磷能力的关系

3 植物对磷素吸收和磷素在植株体内运输

3.1 植物对磷素吸收

3.2 植物体内磷素运输

3.3 突变体技术在研究植物磷素吸收、转运中的作用

4 植物响应磷素胁迫信号的分子机制

4.1 植物应答磷胁迫逆境的基因

4.2 转录因子在植物响应磷胁迫逆境中的作用

4.3 植物磷胁迫响应基因的调控机制

5 植物磷转运蛋白的结构和功能

5.1 植物磷转运蛋白的结构

5.2 磷转运蛋白功能

5.3 植物磷转运蛋白基因的表达与调控

6 本项研究的目的和意义

第一章缺磷条件下不同水稻品种磷素吸收特性的研究

1.1 材料与方法

1.1.1 供试品种和幼苗培养方法

1.1.2 测定性状

1.2 结果与分析

1.2.1 不同磷水平下的单株磷累积量比较

1.2.2 不同磷水平下的单株鲜重、干重和全磷量比较

1.2.3 不同磷水平下植株形态学特性

1.2.4 不同磷水平下供试品种的部分生理参数比较

1.3 讨论

1.3.1 磷胁迫条件下根系磷吸收能力差异是供试水稻品种磷吸收量差异的主要原因

1.3.2 缺磷条件下吸磷量相对较多是磷高效品种生理参数和植株形态学特征相对改善的重要原因

第二章缺磷条件下不同磷效率水稻品种的光合特性和细胞保护酶活性

2.1 材料与方法

2.1.1 供试品种和材料培养方法

2.1.2 测定项目和方法

2.2 结果与分析

2.2.1 不同磷水平下供试品种的单株干重和磷累积量

2.2.2 不同磷水平下供试品种的光合速率

2.2.3 不同磷水平下供试品种的单株叶面积

2.2.4 不同磷水平下的叶绿素含量和可溶蛋白含量

2.2.5 不同磷水平下的气孔导度和蒸腾速率

2.2.6 不同磷水平下的细胞保护酶活性和脂质过氧化特性

2.3 讨论

2.3.1 较高的磷素吸收量是磷高效品种缺磷下具有较多干物质累积量的重要生理基础

2.3.2 叶绿素含量、可溶蛋白含量和Gs 对缺磷下不同磷效率供试品种Pn 的影响

2.3.3 较高的SOD 活性是膜脂过氧化程度低的重要原因，在维持光合器官功能中具有重要作用

第三章低磷胁迫下水稻特异表达基因的鉴定及可能的功能分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料培养

3.1.2 cDNA-AFLP 操作过程

3.1.3 cDNA-AFLP 产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳及银染显影

3.1.4 差异条带DNA 回收和克隆

3.1.5 差异条带DNA 阳性克隆的序列测定

3.1.6 差异表达序列的生物信息学分析

3.2 结果与分析

3.2.1 总RNA 和合成双链cDNA 的检测

3.2.2 cDNA-AFLP 结果

3.2.3 特异表达基因片段的克隆

3.2.4 低磷胁迫下水稻根系特异表达基因和可能的功能分析

3.3 讨论

3.3.1 水稻植株对低磷信号的转导

3.3.2 bHLH 转录因子OsPTF1 和热激应答转录因子参与了下游磷胁迫应答基因的转录调控

3.3.3 低磷胁迫诱发了部分氨基酸及蛋白质合成和物质运输基因的表达

3.3.4 部分生物和非生物逆境应答基因的表达受到低磷逆境诱导

3.3.5 cDNA-AFLP 技术在鉴定低磷逆境及非生物逆境应答基因的局限性

第四章水稻磷转运蛋白基因OsPT2 的克隆、表达和功能研究

4.1 材料与方法

4.1.1 试验材料

4.1.2 水稻磷转运蛋白基因OsPT2 的克隆和序列测定

4.1.3 OsPT2 的编码蛋白特征

4.1.4 OsPT2 的表达特性研究

4.1.5 OsPT2 启动子顺式作用元件的分析

4.1.6 OsPT2 启动子的克隆

4.1.7 融合OsPT2 启动子表达载体构建和农杆菌遗传转化

4.1.8 OsPT2 启动子转化烟草、转基因植株分子鉴定和OsPT2 驱动报告基因表达特征

4.1.8.1 烟草遗传转化

4.1.8.2 转基因系分子鉴定

4.1.8.3 转基因植株的组织化学染色

4.1.9 融合OsPT2 的双元表达载体构建、遗传转化和基因功能鉴定

4.2 结果与分析

4.2.1 OsPT2 的基因结构和编码蛋白质特征

4.2.2 OsPT2 的表达特征

4.2.3 OsPT2 启动子调控元件分析和驱动报告基因表达特征

4.2.4 异源表达OsPT2 对烟草磷素吸收能力的影响

4.3 讨论

4.3.1 水稻磷转运蛋白基因OsPT2 具有植物种属磷转运蛋白的特征

4.3.2 OsPT2 在根系中的表达受到低磷胁迫逆境的上调诱导

4.3.3 异源表达 OsPT2 具有改善低磷胁迫下烟草的磷素吸收能力

第五章水稻磷转运蛋白基因OsPT4 的分子特征、表达和功能研究

5.1 材料与方法

5.1.1 试验材料

5.1.2 水稻磷转运蛋白基因OsPT4 的克隆和序列测定

5.1.3 OsPT4 的编码蛋白特征

5.1.4 OsPT4 的表达特性研究

5.1.5 OsPT4 启动子顺式作用元件的分析

5.1.6 OsPT4 启动子的克隆、融合OsPT4 启动子表达载体构建和农杆菌遗传转化

5.1.7 OsPT4 启动子转化烟草、转基因植株分子鉴定和OsPT4 驱动报告基因表达特征

5.1.8 融合OsPT4 的双元表达载体构建、遗传转化和基因功能鉴定

5.2 结果与分析

5.2.1 OsPT4 的基因结构和编码蛋白质特征

5.2.2 OsPT4 的表达特征

5.2.3 OsPT4 启动子调控元件分析和驱动报告基因表达特征

5.2.4 异源表达OsPT4 对烟草磷素吸收能力的影响

5.3 讨论

5.3.1 水稻OsPT4 呈叶片中特异表达且受到低磷胁迫的诱导

5.3.2 上调表达OsPT4 具有改善植株在低磷胁迫条件下磷利用效率的功能

结论

参考文献

附录

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致谢

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