ERK1/2信号通路在Jurkat T细胞增殖调控中的作用

论文摘要

目的：通过研究细胞外信号调节激酶1／2（extracellular signal regulated kinase1／2，ERK1／2）信号通路的特异性阻断剂PD98059对小鼠淋巴细胞的活化、增殖和细胞周期的影响，同时研究PD98059对Jurkat T细胞的增殖、细胞周期以及ERK1／2、磷酸化的ERK1／2（phosphorylation-ERK1／2，P-ERK1／2）、细胞周期标志蛋白--反向CCAAT盒结合蛋白（inverted CCAAT box binding protein of 90 kD，ICBP90）的影响，从而探讨ERK1／2信号通路在Jurkat T细胞增殖调控中的作用。方法：无菌分离小鼠淋巴结细胞，不同浓度PD98059处理，加入多克隆刺激剂刀豆蛋白（concanavalin，ConA）刺激，CD69-FITC、CD25-FITC、CD3-PE荧光标记单克隆抗体染色，流式细胞术分析PD98059对淋巴细胞表面活化标志CD69、CD25的影响。藉羧基荧光素乙酰乙酸（carboxy fluorescein diacetate，succinimidyl ester，CFDA-SE）染色，不同浓度PD98059处理细胞，加入ConA刺激，流式细胞术分析PD98059对淋巴细胞增殖的影响；选取最佳浓度PD98059处理细胞，加入ConA刺激，流式细胞术分析不同时间PD98059对淋巴细胞增殖的影响；不同浓度PD98059处理细胞，加入ConA或二丁基佛波醇酯（phorbol 12, 13-dibutyrat, PDB）加离子霉素（ionomycin，Ion）刺激，碘化丙锭（propidiumiodide，PI）染色并结合流式细胞术分析PD98059对小鼠淋巴细胞细胞周期的影响。同时采用CFDA-SE染色和MTT法检测不同浓度PD98059对Jurkat T细胞增殖的影响，PI染色并结合流式细胞术分析PD98059对Jurkat T细胞细胞周期变化的影响。然后利用不同浓度、不同信号通路特异性阻断剂LY294002、AG490、GF109203X、Genistein以及LY294002联合AG490处理Jurkat T细胞，观察它们对Jurkat T细胞增殖的影响。进而分别选取最佳浓度的PD98059（30μmol／L）、LY294002（30μmol／L）、AG490（30μmol／L）、LY294002（15μmol／L）+AG490（15μmol／L）、GF109203X（5μmol／L）和Genistein（30μmol／L），通过Western Blot检测这些特异性阻断剂于不同时间对Jurkat T细胞中ERK1／2、P-ERK1／2和ICBP90蛋白表达的影响。分析ERK1／2信号通路在调控Jurkat T细胞增殖中的作用及其与其它信号通路之间的关系。结果：荧光标记单克隆抗体染色显示，不同浓度PD98059仅能轻度抑制淋巴细胞表面活化标志CD69的表达，而对CD25的表达没有影响。CFDA-SE染色分析显示，不同浓度PD98059对ConA刺激淋巴细胞的增殖具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖关系（r=0.985，P＜0.01）。选取最佳浓度为30μmol／L的PD98059观察不同时间其对淋巴细胞增殖的影响，结果发现随着时间的延长，PD98059对淋巴细胞的增殖抑制作用逐渐升高（r=0.973，P＜0.01），且抑制率随时间也明显升高。细胞周期分析表明，PD98059可阻止ConA刺激的淋巴细胞进入S期和G2／M期，但亚二倍体峰变化并不明显；PD98059对PDB+Ion刺激淋巴细胞细胞周期的影响与ConA相似，不同的是S期和G2／M期的变化较ConA作用更为明显。MTT法检测显示PD98059对Jurkat T细胞的增殖具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖关系（r=0.960，P＜0.05）。细胞周期分析表明，PD98059可使Jurkat T细胞停滞于G0／G1期。MTT法检测显示不同浓度各种阻断剂对Jurkat T细胞的增殖具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖关系。其中LY294002（r=0.977，P＜0.01）、AG490（r=0.950，P＜0.01）、GF109203X（r=0.980，P＜0.05）、Genistein（r=0.982，P＜0.05）。Western Blot检测显示，PD98059作用3h可部分下调ERK1／2的表达，而其它阻断剂对ERK1／2的表达均无影响；各阻断剂作用24 h对ERK1／2的表达均无影响。PD98059、LY294002作用3 h可明显下调P-ERK1／2的表达，LY294002+AG490、AG490、GF109203X、Genistein也可使P-ERK1／2的表达下调，作用24 h的情况与3 h时类似，只是程度减弱。各阻断剂作用3 h时均能部分上调Jurkat T细胞中ICBP90蛋白的表达，并以PD98059表现最为明显；而在24 h这种上调作用表现更为明显。结论：PD98059仅能轻度抑制小鼠淋巴细胞的早期活化，却能显著抑制原代淋巴细胞和Jurkat T细胞的增殖，且呈剂量依赖关系。这种对淋巴细胞增殖的抑制作用与其使细胞停滞于G1／G0期，阻止细胞进入S期和G2／M期有关，ERK1／2信号通路的的活化是调控Jurkat T细胞增殖的重要途径，PI-3K、PKC、JAK／STAT、TPK信号通路可能与ERK1／2信号通路上游关联。ERK1／2信号通路的阻断导致Jurkat T细胞增殖的抑制可能不是直接通过ICBP90所介导。

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