论文摘要
高致病性人禽流感自1997年首例出现以来,已经波及全球14个国家,截止到2008年4月30日人禽流感确诊病例382人,死亡241人,死亡率高达63%,对人类健康的危害日益严重,因此WHO要求世界各国做好应对流感大流行的防控准备。自古以来,疫苗在控制感染病方面发挥着重要作用。当前高致病性人禽流感H5N1疫苗（大流行流感疫苗）主要集中在灭活全病毒疫苗、裂解疫苗、减毒疫苗等方面的研究进展迅速。灭活全病毒疫苗和裂解病毒疫苗已完成Ⅰ、Ⅱ期临床研究,证明其安全、有效和稳定。但近来研究发现,高致病性人禽流感病毒H5N1的变异、儿童和老人免疫效果不十分满意以及疫苗接种方式繁琐,对其疫苗的研制带来了挑战。因此,当前迫切需要一种具有较好交叉保护、接种简单,且适用于不同年龄人群的大流行疫苗。滴鼻疫苗模拟自然感染诱发的呼吸道粘膜免疫具有刺激机体产生系统和黏膜局部免疫应答反应,且较注射疫苗诱发的系统免疫有更好的交叉免疫保护效果以及具有安全性好、接种简便等优势,而成为当今疫苗研究发展的重要方向。本研究选用WHO推荐的H5N1疫苗株（A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG、A/Anhui/1/2005（H5N1）-RG5、A/Indo/05/2005（H5N1）-RG2）制备抗原,并以MF59为黏膜佐剂,制备滴鼻大流行流感疫苗剂型,免疫Balb/c小鼠,观察其所诱导的系统和粘膜局部免疫应答规律;进一步以不同灭活疫苗安徽株（A/Anhui/1/2005（H5N1）-RG5）、印尼株（A/Indo/05/2005（H5N1）-RG2）、越南株（A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG）滴鼻免疫,观察不同毒株间免疫应答差异与规律,为喷鼻大流行流感疫苗的深入研究提供理论依据。本研究分为三部分:1、制备滴鼻大流行流感疫苗:首先选用WHO推荐的H5N1疫苗株（A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG、A/Anhui/1/2005（H5N1）-RG5、A/Indo/05/2005（H5N1）-RG2）进行病毒接种、毒种批的建立与鉴定;然后制备纯化灭活全病毒抗原、测定抗原HA含量;最后以制备的MF59为粘膜佐剂,与抗原混合吸附,制成大流行流感滴鼻疫苗,符合WHO对大流行流感疫苗制备要求。2、首先对制备的大流行流感疫苗越南株（A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG）的滴鼻免疫,观察其应答效果。通过0、14天两次滴鼻免疫,于不同时间点（7、14、21、28天）采集小鼠血清、肺鼻灌洗液、脾淋巴细胞,检测血清抗体IgG、IgM动态变化、血凝抑制抗体、血清中和抗体、鼻、肺灌洗液特异性IgG、IgA抗体、血清IgG抗体亚型以及脾特异性IgA抗体分泌细胞、特异性(NF-γ和IL-4分泌细胞生成动态变化来评价其粘膜免疫效果。结果显示,大流行流感越南株疫苗可以激发机体血液中产生较强保护性抗体的免疫反应,并可以维持相当一段时间,至二免二周后血抑效价达到1:113±1.5,血清中和抗体效价为1:221±82,抗体亚型的分布以IgG1与IgG2b为主,肺鼻灌洗液中,均可检测到特异性IgA、IgG。特异性sIgA效价略高于IgG,说明该滴鼻疫苗可以激发黏膜局部产生特异性sIgA免疫应答;脾特异性IgA抗体分泌细胞在两次免疫后14天达到维持较高水平,并同时检测到一定水平的与细胞免疫应答相关的特异性INF-γ和IL-4分泌细胞。3、在上述单价疫苗免疫评价的基础上,选用WHO新近推荐的疫苗株印尼株（A/Indo/05/2005（H5N1）-RG2）、安徽株（A/Anhui/1/2005（H5N1）-RG5）与越南株（A/Vietnam/H5N1-PR8/CDC-RG）三价滴鼻免疫评价其应答效果。通过0、14天两次滴鼻免疫,于不同时间点（7、14、21、28天）采集小鼠血清、肺鼻灌洗液、脾淋巴细胞,检测血清抗体IgG、IgM动态变化、血凝抑制抗体、血清中和抗体、鼻、肺灌洗液特异性sIgA、IgG抗体、血清IgG抗体亚型以及脾特异性IgA抗体分泌细胞、特异性INF-γ和IL-4分泌细胞生成动态变化来评价其免疫效果。结果表明,单价和三价大流行流感滴鼻疫苗在加强免疫后两周均会刺激产生较高的血清IgG抗体效价、血抑效价和中和抗体效价;三株单独免疫除产生较高的针对自身抗原的血抑抗体外,还可以产生一定量的H1、H3、B型血抑效价,提示大流行流感疫苗滴鼻免疫对于自身抗原和同型不同株以及不同型别的抗原具有一定的交叉保护效果;三株联合滴鼻免疫二免二周后,较单价滴鼻疫苗免疫保护效果强,从而可以弥补单独安徽株、印尼株对于越南株交叉免疫性低的缺点。此外三价疫苗对于不同型别的抗原H1、H3、B的血抑效价也相对较高,因此在相同免疫应答效果下,三价滴鼻疫苗所需抗原量低、交叉免疫保护效果好。结论:本实验制备的粘膜佐剂MF59具有较好粘膜佐剂效果,对滴鼻免疫抗原有较好的免疫应答辅助作用;所制备的大流行流感滴鼻疫苗,有较好的免疫原性,可以刺激机体产生系统免疫应答和粘膜局部免疫应答,且具有一定的交叉保护效果。其中三价大流行流感滴鼻疫苗所需抗原量低、交叉免疫保护效果好,在应对禽流感病毒变异、扩大免疫接种人群以及简便接种等方面占有优势,为喷鼻禽流感疫苗的深入研究提供理论依据。
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