论文摘要
来源于古菌Aeropyrum pernix K1的酰基氨酰肽酶/酯酶（APE1547）具有超常的热稳定性和双酶活力（酯酶/肽酶）。应用半合理设计的方法对其底物选择性和催化机制进行研究,有助于揭示酶的分子进化机制,促进酶的工业应用。本文应用Error Prone-PCR构建随机突变库,经过两轮随机突变对共约5000株克隆的筛选,获得了酯酶活力提高约6倍的突变体。基因序列测定表明:第一代突变体含有突变R526S,比活力较野生型提高约1.5倍;第二代突变体含有3个新增突变位点E88G、A200T和I519L,其比活力较第一代突变体无变化,表达量较第一代突变体提高约4倍。进化突变体序列和结构分析表明,R526位点在整个脯氨酸寡肽酶家族中高度保守,已有研究表明它是肽底物与酶的S2-P2作用的关键位点。对该位点饱和突变结果显示,突变体的肽酶和酯酶活力发生了明显变化,疏水残基（I、V和L）能够使酯酶活力明显提高,肽酶活力明显降低。通过测定野生型与突变体分步速率和构建酶-底物相互作用的计算机模型,深入地探讨了R526位点对APE1547活性中心及催化机制的影响,确定了R526位点是APE1547肽酶和酯酶活力分歧进化中的标志性位点。
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